电针对脑梗死大鼠神经功能及胶质纤维酸性蛋白表达的影响_脑梗死软化灶胶质增生

　　摘要：目的 观察电针对高血压基础上形成脑梗死大鼠的不同时间点神经功能评分及灶周胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响，证实电针对星形胶质细胞（AST）变化的影响是其促进脑梗死功能恢复的机制之一。方法 双肾双夹法制备RHRSP模型，双侧肾动脉狭窄术后12周，取血压≥l80 mmHg大鼠，电凝法制备大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，随机分为MCAO假手术组、MCAO组（模型组）、穴位治疗组、非穴位治疗组，后两组行电针刺激。MCAO后各组分别于1 d、3 d、7 d、14 d、21 d进行神经功能缺损评分，HE染色观察病理形态变化，GFAP免疫荧光染色观察电针对局灶性脑梗死缺血灶周围GFAP的表达。结果 假手术组大鼠在各时间点神经功能缺损评分均为0分；各时间点模型组神经功能评分均高于穴位治疗组，1 d时两组差异无统计学意义， 3 d、7 d、14 d、21 d，两组差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。3 d时模型组大鼠神经缺损症状最重，而电针组随着时间的延长其神经功能缺损评分在逐渐降低。在各时间点模型组与非穴位组无明显差异。HE染色可见穴位治疗组ASI及组织肿胀较模型组明显减轻。在五个时间点模型组和电针组GFAP表达都明显增高，与假手术组比较（P<0.01），电针组GFAP表达均明显低于同时段模型组（P<0.05）。各时间点模型组GFAP表达与非穴位组比较无显著性差异。结论 穴位电针治疗能下调脑缺血后GFAP表达，进而改善神经功能。
　　关键词：电针；脑梗死； 星形胶质细胞；胶质纤维酸性蛋白；神经功能缺损
　　中图分类号：R743.1 R255.2 文献标识码：A 文章编号：1672
　　脑梗死（cerebral infarction，CI）具有高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率，严重危害中老年人身体健康。研究已经发现星形胶质细胞（astrocyte ，AST）在中枢神经系统生理和病理情况下发挥重要重要作用，这使其成为临床治疗靶点。既往认为AST只对神经元起营养作用，近年来认为其在脑梗死后不同阶段均发挥着重要作用。电针（ electroacupuncture，EA）对CI治疗作用已被公认，但其对CI后AST的作用研究尚不成熟。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在缺血后的反应性胶质细胞中尤为明显，其表达量的多少可作为研究脑损伤后胶质细胞反应的标志[1]。本实验采用易卒中型肾血管性高血压大鼠（RHRSP）稳定的可以模仿人类高血压脑血管改变的一种动物模型，模型复制后血压缓慢升高制成MCAO模型可更好模拟临床脑卒中的发病情况，其研究对临床更有指导价值。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物 选用2月～3月龄，体重80 g～120 g雄性SD大鼠135只（山西省医用实验动物中心提供）。兔抗GFAP抗体、TRITC标记的二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；G6805Ⅱ电针仪为青岛鑫升实业有限公司产品；上海产GD350 S型电凝器；SDP1型大鼠心率血压计（中日友好医院研制）。
　　1.2 模型制备及动物分组 按已建立的方法复制RHRSP模型[2]。用SDP1型大鼠心率血压计测血压，肾动脉狭窄前测量1次，狭窄后每周测量1次。肾动脉狭窄术12周内死亡5只，剔除5只血压低于180 mmHg者，取体重450 g～500 g，血压≥180 mmHg且无脑卒中症状和体征的95只大鼠，参照Wahl等[3]的方法，均选取左侧制备MCAO模型，其中成功制成MCAO模型者90只，另5只MCAO鼠因出血多或手术显微镜下未明确供血是否中断视为不成功，未入组。余下的30只行相同的开颅术，但不凝闭MCA为（MCAO假手术组）。MCAO后随机分组MCAO假手术组、MCAO（模型组）、穴位治疗组、非穴位治疗组，每组每个时间点6只，后两组予以电针治疗，MCAO后穴位组选病灶对侧“百会”、“大椎”用电针仪行电刺激，1次/天，20 min/次，频率75次/min，电流1 mA～2 mA。非穴位治疗组MCAO后在病灶对侧肢体尾部行电刺激。假手术组与模型组仅做相同捆绑不予治疗。
　　1.3 观察指标及方法
　　1.3.1 神经功能缺损评分 根据Berderson[4]评分分级法加以改进，观察其神经和行为学变化。分别于1 d、3 d、7 d、14 d、21 d处死大鼠前观察其行为表现并进行神经功能缺损评分。
　　1.3.2 切片制备、病理学检查、免疫荧光染色 取经梗死灶的脑组织行固定、脱水、浸蜡、包埋及石蜡切片（片厚5 μm） ，行常规HE染色光镜下进行病理观察。GFAP免疫荧光染色，病理图文系统分析。从每张切片选取病灶周围3个不重叠视野，统计出每个视野内GFAP的免疫反应强度，用平均光密度（OD值）表示。
　　1.3.3 统计学处理 所有的数据使用SPSS 17.0 软件包进行统计分析，采用方差分析，
　　2 结 果
　　2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 假手术组大鼠在各时段神经功能缺损评分均为0分；各时间段模型组神经功能评分高于穴位治疗组，1 d时两组差异无统计学意义，3 d、7 d、14 d、21 d，两组差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。3 d时模型组大鼠神经缺损症状最重，而电针组随着时间的延长其神经功能缺损评分在逐渐降低。在各时间点模型组与非穴位组无明显差异。详见表1。
　　2.2 HE染色病理观察 1 d～3 d模型组主要表现为神经细胞坏死征象。7 d模型组和电针组可见脑软化灶，灶内有炎性细胞浸润。14 d模型组肿胀减轻， 病灶中心组织有坏死、脱落。21 d模型组和电针组镜界清楚，神经细胞排列有序，神经细胞变性、坏死不明显，细胞轮廓及核仁较清晰。非穴位治疗组各时间点病理改变与同时间点模型组无明显差异。
　　2.3 GFAP免疫荧光染色 荧光显微镜下见，脑缺血7 d时，各组大鼠脑梗死病灶周围均可见到AST的活化，主要表现为细胞胞体肥大，突起增多。14 d时，AST活化更加明显。在5个时间点模型组和电针组GFAP表达都明显增高，与假手术组比较差异有统计学意义（P<0.01），电针组GFAP表达均明显低于同时段模型组（P<0.05）。各时间点模型组GFAP表达与非穴位组比较无统计学意义。详见表2。 　　3 讨 论
　　有学者认为CI损伤触发了细胞和分子修复机制，其中包括保护机制和神经发生的激活。以往AST仅被视为具有固定脑细胞的功能，目前研究已经发现AST能调节神经元突触的合成和生长，和血管互相作用形成胶质血管网络，不但构成脑的结构，而且是激动、转导信号交流的区域， 胶质血管单位根据胶质细胞的协调信号来调节神经元的活动[5]，并且AST可诱导成年神经干细胞的神经发生。AST在诸多方面发挥重要作用，干预脑缺血后脑组织中AST的表达也许可以成为一个新的治疗方向。
　　CI后出现相应的神经功能缺损体征，在局灶性脑缺血动物模型中，常用的评价缺血损伤的方法有神经行为学评价和形态学评价。本实验按照改进的Berderson评分分级法进行评定，评分标准设定为0～12分更详细，客观性更强。本实验神经功能缺损评分结果显示，不同时段的模型组与假手术组比较均有统计学意义，大鼠造模后均出现不同程度的神经缺损体征，表明脑缺血模型造模成功。同一时段的电针组神经功能缺损评分明显低于模型组（P<0.05或P<0.01），说明电针可降低大鼠脑梗死神经功能缺损评分，进而改善神经功能。
　　是什么促进穴位电针治疗神经功能缺损评分明显降低，已有研究发现，GFAP阳性细胞的增加有助于大鼠在水迷宫测试中行为参数的变化，AST的活化可能介导了脑缺血大鼠的功能恢复。GFAP是AST的特征性蛋白，在缺血性脑损伤早期梗死毗邻区 GFAP表达迅速增高[6]。既往的研究表明，GFAP反应性胶质细胞肥大和增生在神经元损伤修复方面具有重要作用。而近年关于电针调节AST活化状态的研究也颇多。甘云波等[7]发现针刺可抑制胶质增生，从而有可能为神经再生和功能重建提供更有利的生存环境。王黎等[8]认为电针能明显减轻或抑制缺血的大鼠海马神经胶质细胞的损害。本实验研究证实：在MCAO后1 d、3 d、7 d、14 d及21 d时，模型组和电针穴位组GFAP的表达都明显高于假手术组（P<0.01）。而电针组GFAP的表达均明显低于同时段模型组（P<0.01）。说明电针抑制脑缺血后星形胶质细胞的过度增殖活化，从而可能下调了星形胶质细胞活化后的一系列损伤反应，更有利于发挥星形胶质细胞对神经元的保护效应，从而有利于缺血损伤的修复，本实验神经功能改善是电针影响AST表达机制之一。
　　参考文献：
　　[1] Kajihara H，Tsutsumi E，Kinoshita A，et al.Activated astrocytes with glycogen accumu lation in ischemic penumbra during the early stage of brain infarction：Immunohistochemical and electron microscopic studies[J].Brain Res，2001，909（12）：92101.
　　[2] 黄如训，曾进胜，苏镇培.易卒中型肾血管性高血压大鼠模型[J].中国神经精神疾病杂志，1991，17：257259.
　　[3] Wahl F，Allix M，Plotkine M，et al.Neurological and behavioral outcomes of focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke，1992，23：267272.
　　[4] Berderson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion，evaluation of the model and deveolpment of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17：472476.
　　[5] Kim J H，Park JA，Lee SW，et al.Blood neural barrier：Intercellular communication at gliovascular interface[J].J Biocem Mol Biol，2006，39（4）：339345.
　　[6] Bidmon HJ，Jancsik V，Schleicher A，et al.Structural alterations and change sin cytoskeletal proteins and proteoglycans after focaI cortical ischemia[J].Neuroscience，1998，82（2）：397420.
　　[7] 甘云波，黄光英，张明敏.针刺对脑缺血胶质增生的影响[J].武汉大学学报，2007，28（3）：229331.
　　[8] 王黎，赖新生.电针对血管性痴呆模型大鼠海马神经胶质细胞及微血管的影响[J].针刺研究，2003，28（4）：251254.

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