耶氏肺孢子菌肺炎分子生物学诊断方法研究进展

唐秀文

【关键词】肺炎;耶氏肺孢子菌;聚合酶链式反应;宏基因组二代测序技术

中图分类号：R563.1+1 文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.015

耶氏肺孢子菌肺炎（PJP）是一种由耶氏肺孢子菌（PJ）引起的呼吸系統机会性感染，常见于免疫功能低下或缺陷者。近年来，接受高效抗逆转录病毒治疗（HAART）和肺孢子菌肺炎预防措施的HIV感染患者发生PJP的概率明显减少，但随着癌症患者、器官移植者、老年患者、先天性或获得性免疫缺陷及因其他疾病而接受免疫抑制剂等肺孢子菌肺炎高危人群的扩大，临床肺孢子菌肺炎患者日趋增多，年病死率达30%～50%[1～2]。PJP患者的临床症状、体征、X线胸片及常规实验室检查均无特异性，易漏诊和误诊。目前耶氏肺孢子菌缺乏稳定、可靠的体外培养系统，无法从培养方法获得;血清β-D-葡聚糖（BDG）检测敏感度高，但缺乏特异性[3～4];只能作为辅助诊断指标。目前诊断PJP的检查“金标准”仍然是下呼吸道标本通过染色镜检发现特征性包囊和滋养体，推荐的GMS染色对包囊染色特异性好，对比性强，菌体容易辨认，故在临床得到广泛应用，但受限于标本质量、肺孢子菌的载量、检验师的从业经验以及耶氏肺孢子菌的形态多形性，检出率较低，因此孢子菌肺炎的早期诊断比较困难。科学家们用分子生物学方法探求PJP的病原体，使用分子生物学方法检测耶氏肺孢子菌采用的基因序列有：肺孢子菌线粒体大亚基核糖体核糖核酸（mitochondrial partial LSU rRNA gene，mtLSU rRNA）、内源转录间隔区序列（internally transcribed spacer，ITS）、主要表面糖蛋白（the major surface glycoproteins，MSG）及二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）等。本文主要综述不同分子生物学诊断方法检测耶氏肺孢子菌的研究进展。

1耶氏肺孢子菌分子生物学检测方法

1.1普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）聚合酶链式反应是美国科学家Kary Mullis在20世纪80年代发明的一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，并以此获得诺贝尔化学奖。国外在1990年首次报道应用PCR技术从宿主肺泡灌洗液（BALF）中检出PJ-DNA，2006年，将PCR与免疫荧光法（IFA）两种方法对比，结果显示PCR方法敏感性更好。而GMS染色镜检法与PCR两种方法相比则PCR的敏感性更高，更适合于临床无创性标本的检测。国内有关 PCR方法用于肺孢子菌肺炎（PCP）的文献荟萃分析，大部分文献证明PCR检测法诊断PCP的敏感性和特异性明显高于其他检测法，但普通的PCR易受环境污染，具有一定的假阳性，可以用于临床PCP患者的筛选，还可用于临床治疗效果评价[5]。

1.2巢式聚合酶链式反应（nested polymerase chain reaction，Nested-PCR）巢式PCR 方法是在常规PCR技术基础上发展起来的一种新方法，通过两轮PCR反应，先后使用两对引物，从极少量的模板扩增特异性DNA片段。1990年，相关研究以 pAZ102-E和pAZ102-H为引物，在患者支气管肺泡灌洗液标本中扩增出肺孢子菌mtLSUrRNA片段，并证实PCR技术可以识别临床数据和银染色的假阳性及假阴性诊断，检出率远高于GMS染色法，可以用于早期诊断，漏诊率和假阳性发生率低。国内有研究通过mtLSU巢式PCR对98例呼吸疾病急性发作期患者的103 份标本进行检测，发现mtLSU巢式PCR可以扩增出最低含量为366 fg的肺孢子菌基因，具有很高的灵敏性，8种其他真菌和细菌的DNA样本均未扩增出目的片段，具有高度的特异性[6]。极大地提高了病原微生物检测的敏感性和特异性，但其延长了检测时间，也增加了检测成本。

1.3实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR，qPCR）qPCR是对样品特定的DNA进行定性及定量分析的PCR。通常使用荧光标记引物，通过仪器连续监测每一次扩增反应后的产物含量，获得反应动力学曲线，得出样品中的起始浓度。qPCR与普通PCR相比在检测疑诊PJP患者的阳性率方面更节约时间，同时保持着较高的敏感性。而直接免疫荧光测定法（DFA）和qPCR两种检测方法检测宿主PCP感染率的结果表明，qPCR特异性和敏感性显著高于DFA。国内有学者应用qPCR技术与GMS染色对艾滋病合并肺部感染患者的BALF标本进行肺孢子菌检测，发现在标本量少的情况下，qPCR法检测肺孢子菌阳性率为53.8%（21/39），GMS染色法阳性率仅为2.5%（1/18）。RUIZ-RUIZ等[7]发明了一种新的实时PCR方法检测肺孢子菌，即设计了Msg和mtLSUrRNA两套引物，加入SYBR Green为荧光染料，与基于肺孢子虫mtLSUrRNA序列的巢式PCR方法进行比较，发现巢式PCR检测结果为阳性的70例标本，实时PCR检测均为阳性;3例巢式PCR检测为阴性的样本经实时定量PCR法检测为阳性。此方法使用多重PCR，并用SYBR Green染料替代荧光探针，增加了检测样本中靶基因数，提高了检测灵敏度，节约了检测时间和成本。用qPCR检测肺孢子菌可为临床区分患者定植和感染，选择治疗方案提供参考，并且其检测过程均在封闭条件下进行，可有效防止样本污染。

1.4环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）LAMP是2000年日本科学家Notomi发明的一种核酸扩增技术，该方法采用了一种具有链置换功能的BstDNA聚合酶和四种专门设计的引物，可以识别目标DNA上的6个不同的序列，只有6个序列全部匹配时才能继续扩增，因此大大提高了特异性。该方法很好地结合两种技术的优点，既能缩短报告时间，操作简便，还能区分定植和感染。XUE等[8]也在LAMP的基础上增加了实时检测，改良的LAMP检测方法与其他常见的肺微生物无交叉反应性，其敏感性是常规PCR的1000倍。使用该方法检测403例患者，其中281例（69.7%）检测到肺孢子菌的定植，且间质性肺疾病比在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中更常见，与稳定的COPD患者相比，COPD急性加重患者的吉氏杆菌定植患病率更高。HUBER等[9]将LAMP反应与荧光实时检测相结合，将报告时间缩短至10分45秒至31分15秒，其中平均动手时间为2分45秒，测试运行的平均时间为9分38秒。该方法很好地结合两种技术的优点，既能缩短报告时间，操作简便，还能区分定植和感染。2015年，张楠等人[10]在肺孢子菌16s rRNA保守序列设计引物，建立了LAMP法检测肺孢子菌基因，最低检出拷贝数为50 copies/mL，敏感性高于普通PCR最低检出拷贝数（104 copies/mL），并且与其他病原体无交叉反应，具有较高特异度。LAMP检测对抑制剂的敏感性较低，因此可以直接在呼吸标本中进行，既能缩短报告时间，操作简便，还能区分定植和感染。缺点是引物设计复杂，反应涉及多种酶，不能进行长链DNA扩增，易出现假阳性。

1.5荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）FISH是一种非放射性原位杂交技术，原理是利用报告分子（如生物素、地高辛等）标记核酸探针，然后将探针与靶DNA杂交而形成探针及DNA杂交体，利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系对靶DNA进行定性、定量及定位分析。免疫功能低下的患者难以利用痰液及肺泡灌洗液标本诊断肺孢子菌肺炎，因此人体组织样本更具诊断价值。DE SOUSA等[11]对30个石蜡包埋组织样本进行荧光原位杂交试验，以Grocott染色作为参考标准，并用呼吸道分泌物的实时PCR进行评估，证实FISH是一种肺组织中的肺孢子菌检测高度敏感的筛查方法;而石蜡包埋活检的特异性不理想，在FISH筛查结果呈阳性的情况下，需要使用其他技术进行验证性检测。在呼吸道分泌物中，吉氏梭菌特异性FISH检测的诊断应用具有可接受的敏感性和良好的特异性。

1.6其他聚合酶链反应

1.6.1降落聚合酶链反应（touchdown PCR，TD-PCR）在PCR反应过程中，其他条件保持不变，退火温度每个循环降低1 ℃，从高于Tm值逐渐降低至低于Tm值，在最低退火温度下循环10次左右，使特异性产物富集而降低非特异性产物。有人开发了一种基于肺孢子菌二氢叶酸还原酶基因的定量TD-PCR，并将此方法用于临床呼吸道标本检测，证明具有较好的敏感性和特异性，可区分定植和感染。

1.6.2PCR熔解曲线技术（melting curve PCR，MC-PCR）在扩增反应完成后，逐渐增加温度使双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，监测每一步的荧光信号可产生熔解曲线，在扩增产物的熔解温度上有一特征峰可以区分特异产物与非特异产物。BERNAL-MARTNEZ等[12]发现一种基于real-time PCR的MC-PCR方法，可用于鉴别肺孢子菌和结核分枝杆菌及其他真菌感染。

1.7宏基因组测序法（metagenomic next-generation sequencing， mNGS）mNGS是一种不依赖传统的微生物培养，基于二代测序技术的高通量测序方法，可快速准确地检出所有微生物，覆盖范围广，检测时间短，准确性和灵敏度高于传统病原体检测[13]。随着测序技术的飞速发展，测序成本呈指数级下降，推动了mNGS技术的快速普及，在临床上被广泛应用于病原体快速诊断和抗生素耐药性监测等。HUANG等[14]用mNGS对127份传统病原体检测阴性的肺部样品进行鉴定，结果显示其中120份为阳性，包括了许多传统病原体检测方法通常无法检出的真菌如肺孢子菌、霉菌等，以及容易检出的病原菌如铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌及鲍曼不动杆菌等。与传统病原体检测相比，mNGS敏感性更高（前者为25.73%，后者为88.30%），而特异性较低（前者为88.41%，后者为81.16%）。JIANG等[15]用mNGS对60例非HIV感染的PJP患者和134例诊断为非PJP肺炎患者的肺泡灌洗液及血清样本进行鉴定，与传统的检测方法Gomori甲胺银染法和血清（1，3）-β-D-葡聚糖对比，发现mNGS诊断PJP的敏感性为100%，显著高于Gomori甲胺银染色（25.0%）和血清（1，3）-β-D-葡聚糖（67.4%），mNGS的特异性（96.3%）明显高于血清（1，3）-β-D-葡聚糖（81.4%），mNGS能有效鉴别患者的合并感染，在mNGS诊断后，71.7%的PJP患者修改了最初的抗菌治疗方案。XIE等[16]通过mNGS早期明确诊断后，临床依据结果调整患者治疗方案，患者28 d、90 d生存率均有所提高，90 d生存率从57.7%提高至83.3%。mNGS受抗生素影响小，在使用抗生素前提下，mNGs的阳性率 （91.3%）显著高于传统方法（43.5%）[17～18]，ZHANG等[19]和CAMARGO等[20]研究均发现用mNGS与涂片镜检结果比较，mNGS敏感率和特异性明显优于涂片镜检方法。最近，mNGS作为一种多功能的诊断工具，已成功地用于各种传染病中，与传统方法相比，PJ的检测阳性率增加[21～22]。另外，使用抗菌药物对mNGS影响很小，mNGS有比传统方法更快更准确的诊断优势，LI等[23]使用mNGS技术成功诊断PJP。因此mNGS能检测和鉴定包括真菌、细菌及病毒等多种病原体，明显提高病原体检出敏感率和特异度，尤其对混合感染的检测更具优势;但也有局限性，存在去人源化难度大、对RNA病毒检出率低、真菌和结核菌提取DNA相对困难及可检测标本中多种病原体等问题，所以临床医生需要结合患者的临床症状、检查资料及流行病学资料综合分析，避免非致病菌干扰并作出正确判读。

2小结

近年来随着分子生物学技术不断用于临床疾病诊疗的探讨，也运用于PJP诊断研究中，明显提高敏感性和特异性。即七种分子生物学方法检测阳性率均高于涂片染色镜检。但每种方法各有优劣势，普通PCR可作为筛查项目;qPCR及LAMP等技术能有效区分定植为临床诊疗提供参考。mNGS能快速进行病原体鉴别，可同时鉴定出多种病原体，对混合感染的检测具有优势，对抗生素耐药性分析、疾病风险评估等个性化诊断，为推进精准医疗，實现患者的个性化治疗提供技术支持，具有较好的发展空间。但是也有局限性，不能区分感染和定植。为了使这些新技术为临床诊疗发挥更好的作用，相关专业委员会发布了相应专家共识[24～26]。在耶氏肺孢子菌肺炎临床诊疗中应根据实际情况选择适合的分子生物学方法，建议用多种方法联合检测，可以提高病原体诊断的准确性，减少漏诊和误诊。

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（编辑：潘明志）

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