镉污染对稻田土壤真菌群落结构及多样性的影响

罗路云，蒋宏华，王殿东，郑立敏，张德咏，曾军，彭俊彩，张卓*

（1长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆 408100；
2湖南省农业科学院蔬菜研究所，湖南长沙 410125；
3湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南长沙 410125；
4新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆乌鲁木齐 830000；
5湖南省农业装备研究所，湖南长沙 410125）

【研究意义】重金属在自然界中广泛存在，在自然环境中难以降解，易沉积到土壤、水底被生物吸收，并进一步通过食物链累积而危害人体健康（Olaniran et al.，2013）。镉是毒性最强的重金属元素之一，能占用其他必需元素金属离子的运输通道，导致植物对营养元素的吸收及代谢活性降低，抑制植物生长（Kaur and Garg，2018；
Menahem and Meni，2018）。镉污染对作物生长、土壤微生物及土壤酶活性均具有不同程度的影响（廖洁等，2017；
谢朝等，2020）。研究表明，镉在土壤中被生物体吸收积累后，通过与土壤酶—底物复合物相互作用使酶蛋白变性或与蛋白活性基团相互作用来降低酶活性，进而通过影响微生物细胞合成酶来干扰土壤生物的正常生命活动（徐佳慧等，2020）。水稻是我国重要的粮食作物，目前我国水稻农田仍存在严重的镉污染问题，降低镉在土壤中的生物有效性和阻止其经由水稻根系向地上部及稻米迁移变得非常重要（Hrynkiewicz et al.，2018）。因此，探究不同程度重金属污染下土壤微生物的变化对筛选可供生物修复的耐重金属微生物具有重要意义。【前人研究进展】自然情况下镉在土壤中浓度较低，但含镉肥料及农药的使用及采矿和冶炼等均会增加土壤中的镉含量（Liu et al.，2007；
史晓凯等，2014）。研究发现，微生物与植物协同作用能在一定程度上吸收和富集有毒重金属（Wang et al.，2018；
Zhang et al.，2018）。重金属对土壤微生物在短期内的影响主要倾向于降低微生物多样性，污染严重的土壤中细菌通常具有更低的丰富性、均匀性和多样性特征（Luo et al.，2019）。Rajapaksha等（2004）研究了不同浓度锌或铜污染对土壤微生物活性的影响，结果表明细菌活性随着重金属污染水平的升高而降低，然后慢慢恢复到与对照土壤相似水平，真菌活性随重金属污染程度的增加而增加。王奥等（2011）研究发现，镉胁迫改变了紫色土细菌群落结构而对冲积土的细菌群落结构影响较小，高浓度镉胁迫均显著降低了各类可培养微生物数量。谢学辉等（2012）研究发现铜矿尾矿土壤中微生物多样性除与有机碳、有机质、含水率等相关性较高，还受多种重金属的影响，而在样品中含量普遍比较高的重金属如铜、镉等并不是影响微生物多样性的主要因素。Bourceret等（2016）将种植紫花苜蓿的地块与裸露地块进行比较，发现短期的重金属污染通常会降低土壤微生物多样性，但随着时间推移，微生物多样性慢慢升高。廖洁等（2017）研究发现高浓度镉（浓度达100 mg/kg）能显著抑制甘蔗的生长和产量，降低土壤酶活性，并显著降低土壤中真菌、细菌和放线菌数量。闫华等（2018）研究发现，不同程度重金属污染对稻田土壤真菌群落结构有显著影响，且随着污染程度的增加，抗逆真菌如类球囊霉属（）、四枝孢霉属（）、根囊壶菌属（）等的相对数量和种类显著增加，敏感真菌如被孢霉属（）、木霉属（）、离壳菌属（）和菇属（）等的相对数量急剧减少。Luo等（2019）研究发现镉胁迫可改变稻田土壤细菌群落，镉污染水平越高，土壤细菌多样性越低，同时发现放线菌属（）对镉具有较强的耐受性。王宁等（2021）研究表明，镉胁迫可提高苗期小麦根际土壤中细菌群落的多样性，改变细菌群落结构。【本研究切入点】目前，前人研究主要集中在耐重金属土壤微生物分离筛选及污染土壤的微生物修复，但在长期重金属污染的田间环境中真菌群落结构随重金属污染程度的变化还需进一步研究。【拟解决的关键问题】以湖南某镉矿周边不同镉污染程度（高、中和低）水稻田为研究对象，采集土壤样品，测定土壤养分含量，利用Illumina MiSeq高通量测序技术分析土壤真菌群落结构，对比不同镉污染组土壤真菌群落多样性和群落结构差异，探究镉胁迫对稻田土壤养分含量、土壤真菌群落结构及多样性的影响，为阐释镉胁迫对稻田土壤微生物多样性的影响规律提供科学依据。

1.1 试验地概况

试验地位于湖南省湘潭市某镉矿区附近，采样点在取样前种植同一品种水稻，均进行相同的田间农事管理。试验地光能资源丰富，历年平均日照时数1700 h左右，全年平均气温17℃左右，降水量1400 mm左右。

1.2 样品采集

选取该矿区及其周边1 km的7个相邻水稻田作为研究对象，采样点分别命名为TZ、HX、HX1、SA、QN、XT和YT。每个水稻田采集8个生物重复样品，每个重复设置1 m×1 m样方，采用五点抽样法收集20 g土壤样品作为一个重复样品。根据GB 15618—2018《土壤环境质量标准 农用地土壤污染风险管控标准》以及样品组总镉浓度差异，分别将其划分为高镉组（H：TZ采样点，总镉含量＞3.0 mg/kg），中镉组（M：HX和HX1采样点，总镉含量0.3～3.0 mg/kg）和低镉组（L：SA、QN、XT和YT采样点，总镉含量＜0.3 mg/kg）。移除土壤样品中的植物材料、沙子和石头，将样品置于4 °C冷藏器并运送至实验室。筛选和均质化样品，将每个土壤样本进一步分为2组，第1组风干后用于理化性质测定，第2组储存在-80 °C冰箱用于DNA提取。

1.3 理化性质测定

按照国家标准GB/T17141—1997《土壤质量铅、镉的测定 石墨炉原子吸收分光光度法》和GB/T23739—2009《土壤质量 有效态铅和镉的测定 原子吸收法》的方法测定总镉（TCd）和有效镉（ACd）含量。采用玻璃电极测量土壤pH（土水比1∶25）。土壤全氮、全磷、全钾、速效磷、速效钾含量测定参考Jiang等（2016）的方法，微量凯氏定氮法测定土壤总氮含量，HClO-HSO消化法测定土壤全磷和全钾含量，钼蓝比色法测定速效磷和速效钾含量。土壤有机质含量采用湿氧化法测定（Luo et al.，2019），土壤碱性水解氮采用碱性水解氮法测定（鲍士旦，2005）。

1.4 土壤样品DNA提取、PCR扩增和测序

每个样品准确称取0.5 g，使用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals，USA）提取土壤样品总基因组DNA。使用NanoDrop 2000测定样品总DNA浓度和纯度，纯度A260/A280值要求在1.8～2.0。所有样品基因组DNA浓度在扩增前定量到30 ng/µL，-20℃冰箱保存。以样品基因组DNA为模板，选用gITS7（5"-GTGARTCATCGARTCTTTG-3"）和ITS4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）对样品进行扩增（Kong et al.，2020）。PCR反应体系50.0μL：5.0μL 10×PCR buffer（含20 mmol/L MgCl），1.5μL dNTP（10 mmol/L），1.0 UDNA聚合酶，1.0μL DNA模板，灭菌ddHO补足至50.0μL。PCR扩增程序：94℃预变性1 min；
94℃20 s，57℃25 s，68℃45 s，进行38次循环；
最后68℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，纯化PCR产物送至北京新科开源基因科技有限公司进行二代高通量测序（Illumina Hiseq 2500，读长为PE250）。

1.5 数据分析

原始序列经双端拼接、过滤和去除嵌合体后，得到优化序列（Edgar et al.，2011；
Kong，2011；
Magočand Salzberg，2011）。调用UPARSE程序（Edgar，2013）在97%序列相似度水平下划分OTU，得到OTU表和代表序列。通过RDP-Classifer（Version 2.10）调用Unite数据库对OTU序列进行物种注释，得到OTU代表序列各分类水平的物种分类信息。通过标准化OTU表计算每个土壤样品的香农指数（Shannon index）、辛普森指数（Simpson index）、丰富度（Observed richness）和丰富度指数（Chao1 index），以此评估不同土壤样品组之间的α多样性。使用基于Bray_curtis矩阵的加权主坐标分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）及多重响应置换程序（MRPP）、相似性分析（Anosim）和非参数检验方法（Adonis）等评估两组间土壤样品真菌群落的β多样性。数据处理通过Galaxy平台及其集成软件（http：//rccc.ou.edu）完成。

1.6 统计分析

使用SPSS 22.0进行统计分析，通过基于Duncan算法多重比较后的单因素方差分析评估高镉组、中镉组和低镉组之间土壤样品α多样性指数差异；
基于Pearson相关系数分析理化性质与α多样性之间的相关性。

2.1 不同镉污染稻田土壤真菌OTU分析

原始数据经质控后共获得2659590条高质量序列，序列数在18382～101542条，每组样品在97%相似度下经标准化后共获得3462条OTU。单组样品OTU测序量达150000以上，稀释曲线虽尚未趋于平缓，但测序量满足数据分析要求（图1）。

为进一步研究不同镉污染组间共有及特有OTU，构建不同镉污染组OTU分析韦恩图（图2）。根据差异OTU分析结果，发现不同处理组样品共有OTU数为619，高镉组、中镉组和低镉组的特有OTU数分别为76、318和1290。高镉组与中镉组共有OTU数为785，特有OTU数分别为177和961；
中镉组与低镉组的共有OTU数为1262，特有OTU分别为484和1391；
高镉组与低镉组的共有OTU数为720，特有OTU数分别为242和1933。

2.2 不同镉污染稻田土壤真菌α和β多样性分析

2.2.1 土壤真菌α多样性分析对高镉组、中镉组和低镉组水稻土壤真菌α多样性进行分析，结果（图3）表明，中镉组和低镉组稻田土壤的真菌香农指数、辛普森指数、丰富度指数均显著高于高镉组（＜0.05，下同）；
稻田土壤的真菌Chao1指数在不同镉污染组间均具有显著差异，表现为低镉组＞中镉组＞高镉组。由此可知，高镉组、中镉组和低镉组稻田土壤的真菌α多样性随着镉污染水平升高呈降低趋势，高镉组α多样性显著低于中镉组和低镉组，但中镉组和低镉组间差异较小。

图1 不同镉污染采样点稀释曲线Fig.1 Dilution curve of different cadmium pollution sampling sites

图2 不同镉污染组OTU分析Fig.2 OTU analysis among different cadmium pollution groups

2.2.2 土壤真菌β多样性分析 使用基于Bray_curtis矩阵的加权主坐标分析及多重响应置换程序、不相似性分析和多元方差分析评估2个不同采样点间土壤样品真菌群落的β多样性。加权主坐标分析结果（图4）表明，低镉组和中镉组、高镉组稻田土壤真菌群落分离明显；
中镉组、高镉组稻田土壤真菌群落距离较近，pCoA1和pCoA2共解释31.87%的真菌群落变异，其中pCoA1解释18.49%的土壤真菌群落变异，pCoA2解释13.38%的土壤真菌群落变异。不相似分析结果（表1）表明，高镉组土壤样品真菌群落（TZ）与中镉组（HX、HX1）、低镉组（SA、YT、QN、XT）样点间具有显著或极显著（＜0.01，下同）差异；
中镉组土壤样品真菌群落（HX、HX1）与低镉组（SA、YT、QN和XT）各样点间也均具有极显著差异；
低镉组土壤样品真菌群落在YT和XT样点间无显著差异（＞0.05，下同），其他样点间均具有极显著差异；
中镉组HX和HX1样点间土壤真菌群落差异极显著。

2.3 不同采样点稻田土壤真菌在门和属分类水平的物种分析

在门分类水平上对每组样品的相对丰度分布进行分析并绘制优势物种相对丰度柱形图（相对丰度＞1%），结果（图5）显示，不同土壤样品中各门的丰度不同，但子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）在所有样品组中均属优势菌门，相对丰度在51.09%～81.93%。高镉组（TZ）的优势门为子囊菌门、担子菌门、Chlorophyta、被孢霉门和壶菌门（Chytridiomycota）；
中镉组（HX和HX1）的优势门为子囊菌门、担子菌门、Chlorophyta、被孢霉门和壶菌门；
低镉组中，QN样点的优势门为子囊菌门、担子菌门、Chlorophyta、被孢霉门和壶菌门，SA和XT样点的优势门为子囊菌门、担子菌门和被孢霉门，YT样点的优势门为子囊菌门、担子菌门、Chlorophyta、被孢霉门和壶菌门。

对不同采样点土壤真菌中平均相对丰度大于1%的属进行差异分析，结果（表2）显示，金孢属（）在中镉组和高镉组的相对丰度显著高于低镉组；
韧伞属（）、篮状菌属（）、属在高镉组的相对丰度显著高于中镉组和低镉组；
被孢霉属（）、枝鼻菌属（）、小带孢霉属（）、木霉属（）在中镉组的相对丰度显著高于低镉组和高镉组；
属在低镉组的相对丰度显著高于中镉组和高镉组；
掷孢酵母属（）、粉褶蕈属（）、枝孢属（）、、弯孢属（）、和链孢霉属（）在各镉污染组的相对丰度无显著差异。

图3 不同镉污染组稻田土壤真菌α多样性分析Fig.3αdiversity analysis of fungi in paddy soil in different cadmium pollution groups

图4 不同采样点主坐标分析Fig.4 Principal co-ordinates analysis of different sampling sites

表1 不同采样点不相似性分析Table 1 Dissimilarity analysis of different sampling sites

图5 不同采样点土壤真菌在门水平上的相对丰度Fig.5 Relative abundance of soil fungi at phylum level in different sampling sites

2.4 真菌群落结构与环境因子的相关分析

将土壤真菌群落结构与环境因子进行相关分析，结果（表3）表明，总氮和总钾与土壤真菌群落结构无显著相关性，pH、碱性氮、有效磷、有效钾、总磷、有机质、总镉及有效镉均与土壤真菌群落结构呈极显著正相关，表明这些环境因子均可影响土壤真菌群落。

为进一步了解土壤理化因子与真菌群落变化的对应关系，对不同镉污染组土壤样品的真菌群落进行CCA分析，结果（图6）表明，第一轴（CCA1）和第二轴（CCA2）分别解释30.06%和14.40%的真菌群落差异，共解释44.46%的真菌群落变异。不同镉污染组土壤样品分离明显，总镉、有效镉、总磷、有效磷、有机质与镉胁迫下真菌群落的变化显著正相关，pH、有效钾、总氮、总钾与真菌群落的变化显著负相关。

研究表明，短期重金属污染胁迫会降低土壤微生物的丰度和多样性（王奥等，2011；
Bourceret et al.，2016）。本研究中，稻田土壤真菌α多样性随着镉污染水平升高呈降低趋势，高镉组α多样性显著低于中镉组和低镉组，但中镉组和低镉组之间差异较小，表明镉污染水平升高可降低土壤中真菌群落α多样性，而中、低镉组α多样性差异较小，推测其原因可能是高浓度镉胁迫下真菌更敏感；
高镉浓度下微生物多样性均显著降低表明菌株受重金属胁迫时，活性氧自由基在细胞中累积，超过一定阈值即与膜质和生物大分子反应，从而破坏生物膜结构，这可能也是镉胁迫下α多样性降低的重要原因。

不同重金属元素对土壤真菌群落结构的影响存在差异。闫华等（2018）研究4种重金属污染对真菌群落的影响时发现，铅和铜污染对真菌群落结构的影响最显著，镉次之，锌的影响最小。许洪扬等（2021）发现与湖南省重金属修复地方标准相比，采样区4种重金属锌、铅、镉、铜的污染程度依次降低，重金属污染显著改变真菌群落的组成和结构。本研究中，基于Bray_curtis矩阵的加权主坐标分析和不相似分析结果表明，高镉组、中镉组和低镉组稻田土壤的真菌群落具有显著差异，表明镉污染水平升高使土壤真菌群落发生显著变化，镉胁迫下改变了土壤真菌群落结构。同时，主坐标分析中pCoA1和pCoA2共解释31.87%的真菌群落变异，表明镉污染程度是真菌群落变异的重要因素之一。造成这种不同重金属元素影响能力不同的原因可能是土样的重金属元素浓度、土壤类型和基本性质等存在差异，从而导致不同重金属元素对微生物的毒性出现差异。

表2 不同镉污染组优势属差异分析Table 2 Difference analysis of dominant genera in different cadmium pollution groups

表3 土壤真菌群落和环境因子的相关分析Table 3 Correlations between soil fungal community and environment factor

图6 不同镉污染组土壤样品中真菌群落CCA分析Fig.6 CCA analysis of fungal community in soil samples from different cadmium pollution groups

微生物具有更大的表面积和更高的代谢活性，使其更易受土壤中重金属的影响，重金属可通过吸附、固定、络合、溶解和氧化还原等方式阻碍其生态功能（Vodyanitskii and Plekhanova，2014；
Li et al.，2015）。前人研究表明，镉能通过与土壤酶—底物复合物相互作用来降低酶活性，进而影响土壤生物的正常生命活动（徐佳慧等，2020）。本研究中，子囊菌门、担子菌门和被孢霉门在所有样品组中均属优势菌门，但不同镉污染组优势菌门相对丰度具有显著差异，表明镉污染水平升高改变了土壤真菌种群。除此之外，本研究中高镉组、中镉组和低镉组的特有OTU分别为76、318和1290个，表明随着土壤中镉浓度升高，土壤中特有真菌物种显著降低，可能是因为镉对微生物的毒害作用减少了土壤中真菌的种类。重金属污染胁迫改变原有的群落内部种群竞争关系，导致耐性菌群快速生长，成为重金属污染环境中的优势种群（谢学辉等，2012）。许洪扬等（2021）发现敏感性真菌［球囊菌门（Glomeromycota）］的相对丰度随重金属污染程度的升高而降低，而耐受性真菌［子囊菌门、担子菌门、被孢囊门（Mortierellomycota）、被孢菌属（）、青霉菌属（）和镰刀菌属（）］的相对丰度增加，但在重污染情况下有所减少。本研究中，韧伞属、篮状菌属和属在高镉组的相对丰度显著高于中镉组和低镉组，表明这些真菌对镉具有一定的抗性。有研究表明，与植物根系相关（Hambleton et al.，2005），韧伞属与植物氮积累相关（Philpott et al.，2014），但并未发现其与镉污染相关。Zeng等（2020）发现高重金属降低了土壤中的曲霉属（）、镰刀菌属、柄孢壳菌属（）和赤霉菌属（）等真菌属的丰度，极大增加了链格孢属（）、茎点霉属（）和外瓶霉属（）等真菌属的丰度。

重金属污染土壤的细菌和真菌多样性受到土壤理化性质的影响，土壤微生物群落结构与重金属浓度均相关，同时与土壤参数也存在一定相关性。本研究中，总镉、有效镉、总磷、有效磷、有机质与真菌群落的变化显著正相关，pH、有效钾、总氮、总钾与真菌群落的变化显著负相关。土壤有机质和pH在决定镉的溶解度和形态方面起重要作用，影响镉的迁移率和生物有效性，有机质可通过形成稳定的络合物固定镉离子，从而降低镉的生物有效性（徐佳慧等，2020）。在酸性土壤中，吸附在土壤颗粒上的氢离子会增加无机和有机土壤组分上的正电荷，导致土壤对镉的吸收能力减弱，从而增加土壤生物对镉的吸收。随着镉污染程度增加，土壤中总磷和有效磷显著增加，将为作物提供更多的养分促进作物生长，在一定程度上缓解镉对作物的胁迫（卓晨等，2020）。因此，重金属浓度、理化性质、微生物三者之间相互影响，相互作用，共同形成了复杂的土壤环境。

高浓度镉污染可降低稻田土壤真菌群落的α多样性并改变土壤真菌群落结构。子囊菌门、担子菌门和孢霉门在所有样品组中均属优势菌门，但不同镉污染组优势菌门相对丰度具有显著差异。pH、碱性氮、有效磷、有效钾、总磷、有机质、总镉及有效镉均与土壤真菌群落结构显著相关，是影响土壤真菌群落结构的主要驱动因子。

猜你喜欢 群落真菌稻田 轻度人为干扰下贵州道地药用植物艾纳香群落特征研究山地农业生物学报(2022年3期)2022-05-13缺氮胁迫对小麦根际土壤微生物群落结构特征的影响*土壤学报(2022年1期)2022-03-08巨幅稻田畫亮相瀋陽澳门月刊(2020年7期)2020-07-14人教版生物必修3第4章第4节群落的演替教学设计学校教育研究(2020年7期)2020-04-09千奇百怪的真菌大自然探索(2019年1期)2019-01-24稻田里的写真作文大王·低年级(2019年2期)2019-01-23稻田里的小猪佩奇学苑创造·A版(2018年9期)2018-10-22稻田里的稻草人创新作文(1-2年级)(2018年7期)2018-01-22奇趣的真菌王国知识就是力量(2017年12期)2018-01-15种群和群落及生态系统考题分析中学生理科应试(2017年6期)2017-09-27

推荐访问:群落 真菌 稻田