微波辐射后大鼠肺组织中VEGF和AQP5表达改变特点研究

董红艳， 胡向军， 彭瑞云， 王丽峰， 段昕妤

(1. 61886部队门诊部， 北京 100084；

2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所， 北京 100850；
3.中国人民解放军总医院 第八医学中心消化科， 北京 100093)

微波是指频率在300 MHz～300 GHz，波长在1～10-3m之间的电磁波。微波辐射所属的电磁波区域是辐射产生生物学效应的关键区域[1]，微波辐射广泛存在于人们的日常生活和工作环境之中，因其已成为一种新的环境污染因素而倍受关注。微波对肺脏影响的研究，主要集中在间质性肺炎，有学者认为肺脏是微波损伤的敏感靶器官之一[2]。

前期实验微波模拟源辐射大鼠后，在形态学上观察到肺组织水肿及毛细血管通透性增加中的表达改变，VEGF表达增加，AQP5表达减少，并且有时效性和量效性关系，二者可能参与了微波辐射致血一气屏障损伤的病理生理过程[3-4]。VEGF、AQP5和Occludin等参与了多种原因引起的肺部炎症和肿瘤的发生、发展及治疗过程，是引起肺组织损伤、通透性增加、水肿的重要因素[5]。为此，我们采用Western Blot、RT-PCR等技术，通过对大鼠肺组织中VEGF、AQP5的检测，进一步探讨不同功率微波辐射对大鼠肺组织影响的机制。

1.1 实验动物

二级雄性Wistar大鼠162只，体重(200±20)g，由军事医学科学院实验动物中心提供并统一饲养，室内温度21～23℃，相对湿度60%，随机分为假辐射组和10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2辐射组，其中假辐射组12只，10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2辐射组各50只。

1.2 微波辐射方法

采用军事医学科学院微波辐射源进行全身均匀辐射。大鼠在辐射盒中为固定体位。辐射台旋转以保证全身均匀辐射。平均功率密度为10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2，辐射时间为5 min。假辐射组仅将装有大鼠的辐射盒放于辐射台上，不进行辐射。

1.3 检测大鼠肺组织中VEGF和AQP5表达

各组动物分别于辐射后6 h、1 d、3 d、7 d和14 d称重后，经腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，取肺组织置液氮中冻存，备做蛋白提取及AQP5 mRNA。兔抗VEGF抗体、兔抗AQP5抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；
AQP5和β-actin PCR扩增的成对引物序列购自上海生工生物工程技术服务有限公司；
兔抗actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
PVDF膜、Western发光底物试剂盒购自购自北京普利来基因技术有限公司。

1.3.1 免疫印迹(Western Blot)方法检测大鼠肺组织中VEGF、AQP5

制备肺组织总蛋白后，测定蛋白浓度、上样、电泳、转膜、用PBsT清洗PVDF膜、100 g/L脱脂奶粉常温封闭2 h；
分别加入兔抗VEGF抗体(1∶200)和兔抗AQP5(1∶100)，4℃过夜，PBST清洗3×10 min；
加入生物素标记的二抗(PBS-T液1∶4000稀释)，摇床常温孵育1 h；
PBST清洗3×10 min；
在硝酸纤维素膜上滴加酶的作用底物ECL(带有化学发光剂)，作用1 min后滤纸吸干，塑料保鲜膜包裹后放入暗匣，压X光底片曝光2～30 min，显影，定影。将目的条带扫描后应用CMIAS-Ⅱ图像分析仪，测目的条带的积分光密度(IOD)，将扫描值与β-actin扫描值相比，然后以样本/内参照的比值表示AQP5 mRNA表达水平、VEGF和AQP5蛋白表达水平。

1.3.2 RT—PCR方法检测大鼠肺组织中AQP5

AQP5上游引物mRNA5’-TCCAGGACCACACCAGAAAG-3’，下游引物5’-ATAAAATAGCACTCCGTGAGCC-3’；
β-actin上游引物5’-CTGTGCCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游引物5’-AATCCACACAGAGTACTTGCGCT-3’。参照TRIzol试剂说明书方法提取总RNA，其A260/280在1.7～2.0之间。各组各时间点RNA提取物每1.5 μg中加入Oligo-P(dT)18Primer 0.5 μL，无RNA酶的水补充至6 μL、70℃、5 min；
再加入5×反应液2 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL和dNTP混合物1 μL、37℃，水浴5 min后加入0.5 μL AMV-RT、42℃、60 min；
之后70℃反应10 min、4℃或冷冻保存。以β-actin为内参照进行PCR，突触素AQP5扩增条件为94℃、5 min；
94℃、30 s；
52℃、30 s (β-actin，54℃、30 s)，72℃、30 s；
72℃、5 min；
均为25个循环。取5 μL PCR产物与1 μL DNA上样缓冲液混匀后在10 g/L的凝胶上电泳，用凝胶成像系统扫描分析。

1.4 数据统计处理

2 结果2.1 大鼠肺组织VEGF免疫印迹的变化

可见10 mW/cm2组辐射后6 h，肺组织中VEGF含量与假辐射组相比无明显改变，在1 d、3 d时含量减少(P<0.05)，7 d时见基本恢复；
30 mW/cm2组大鼠肺组织VEGF的改变和恢复时间基本与10 mW/cm2组相似；
100 mW/cm2组于辐射后6 h即见减少，1 d、3 d和7 d持续减少(P<0.05)，至第14 d基本恢复。表明10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2微波辐射后大鼠肺组织VEGF蛋白的表达变化呈先降低后恢复的过程，具有明显的量效关系，即辐射剂量越大，其表达减少越明显，且出现早、恢复迟。

结果见表1及图1。

表1 微波辐射后大鼠肺组织VEGF与β-actin MOD比值变化

图1 微波辐射后大鼠肺组织VEGF蛋白变化Western Blot结果1. 假辐射组；
2. 10 mW/cm2-6 h；
3. 30 mW/cm2-6 h；
4. 100 mW/cm2-6 h；
5. 10 mW/cm2-1 d；
6. 30 mW/cm2-1 d；
7. 100 mW/cm2-1 d；
8. 10 mW/cm2-3 d；
9. 30 mW/cm2-3 d；
10. 100 mW/cm2-3 d；
11. 10 mW/cm2-7 d；
12. 30 mW/cm2-7 d；
13. 100 mW/cm2-7 d；
14. 10 mW/cm2-14 d；
15. 30 mW/cm2-14 d；
16. 100 mW/cm2-14 d

2.2 大鼠肺组织AQP5免疫印迹的变化

辐射后10 mW/cm2、30 mW/cm2组大鼠肺组织中AQP5与假辐射组相比未见显著改变；
100 mW/cm2组大鼠肺组织中AQP5与假辐射组相比降低，其中在辐射后1 d显著降低(P<0.05)，持续至辐射后第3 d、7 d基本恢复。表明100 mW/cm2HPM辐射后大鼠肺组织AQP5蛋白的表达呈先降低后恢复的过程。结果见表2及图2。

表2 微波辐射后大鼠肺组织AQP5与β-actin MOD比值变化

2.3 大鼠肺组织AQP5 mRNA的变化

10 mW/cm2、30 mW/cm2组各时间点未见明显异常，100 mW/cm2HPM辐射后6 h～3 d 大鼠肺组织AQP5 mRNA表达减少，1 d时减少最为明显(P<0.05)，辐射后7 d见恢复，14 d见基本恢复。表明100 mW/cm2HPM辐射后大鼠肺组织AQP5 mRNA表达呈先减少后恢复的过程。结果见图3及图4。

图2 微波辐射后大鼠肺组织AQP5蛋白变化Western Blot结果1. 假辐射组；
2. 10 mW/cm2-6 h；
3. 30 mW/cm2-6 h；
4. 100 mW/cm2-6 h；
5. 10 mW/cm2-1 d；
6. 30 mW/cm2-1 d；
7. 100 mW/cm2-1 d；
8. 10 mW/cm2-3 d；
9. 30 mW/cm2-3 d；
10. 100 mW/cm2-3 d；
11. 10 mW/cm2-7 d；
12. 30 mW/cm2-7 d；
13. 100 mW/cm2-7 d；
14. 10 mW/cm2-14 d；
15. 30 mW/cm2-14 d；
16. 100 mW/cm2-14 d

图3 微波辐射后大鼠肺组织AQP5 mRNA的RT-PCR检测结果1. 假辐射组；
2. 10 mW/cm2-6 h；
3. 30 mW/cm2-6 h；
4. 100 mW/cm2-6 h；
5. 10 mW/cm2-1 d；
6. 30 mW/cm2-1 d；
7. 100 mW/cm2-1 d；
8. 10 mW/cm2-3 d；
9. 30 mW/cm2-3 d；
10. 100 mW/cm2-3 d；
11. 10 mW/cm2-7 d；
12. 30 mW/cm2-7 d；
13. 100 mW/cm2-7 d；
14. 10 mW/cm2-14 d；
15. 30 mW/cm2-14 d；
16. 100 mW/cm2-14 d

图4 微波辐射后大鼠肺组织AQP5 mRNA与β-actin mRNA IOD比值变化

VEGF是血管内皮细胞的专用肽丝裂原，其家族成员VEGF-A是调节血管功能的最关键因子[6]，有关射线对肺组织VEGF的影响，已有研究表明，肺属于对辐射中度敏感的器官，较高剂量的辐射易造成放射性肺损伤，放射性肺损伤早期表现为组织充血水肿、渗透增加等炎症反应[7]。VEGF是一类促血管生成因子，分为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和VEGF-F六大类型。VEGF-A是目前研究最多，能在一定程度上影响血管新生[8]。放射线可损伤血管内皮细胞，从而导致管腔狭窄或闭塞。而VEGF可以激活血管内皮细胞的活性，增加血管的渗透性，促进血管的新生[9-10]。

水通道蛋白5位于Ⅰ型肺泡上皮细胞，是调节水分子转运的功能性蛋白，生理状态下可协助清除肺泡腔内多余水分，保持肺泡腔干燥环境[11]。MA发现敲除AQP5基因，肺泡透水性较生理状态下可降低10倍，表明AQP5介导肺泡上皮细胞的水分子跨膜转运机制[12]。可见，AQP5的表达与急性肺水肿互为因果，相互促进。但AQP5在ALI过程中对水肿液清除作用的机制仍不明确。多项研究显示[13-14]，不同类型损伤因素致ALI条件下，AQP-5表达趋势不稳定。辐射损伤作用的关键靶点是细胞核内的DNA，射线作用于细胞内水分子产生HO，DNA断裂是辐射损伤的主要机制，水分子被认为是辐射损伤的关键介质[15]。

在前期研究中，观察到一定剂量微波辐射后大鼠肺组织，表现为以出血、水肿为其主要的急性肺损伤的病理改变[3]。VEGF、AQP5在微波辐射致肺损伤中的生物效应和机制未见公开报道，肺组织内VEGF、AQP5的表达非常丰富。那么VEGF、AQP在微波辐射致急性肺损伤时发挥着怎样的作用？肺损伤时的出血、水肿是否与VEGF、AQP有关？为此，本研究采用Western Blot、RT-PCR方法观察VEGF、AQP在微波辐射后大鼠肺组织中的动态变化规律，可见VEGF表达改变与辐射剂量呈正相关，三个辐射剂量组中的表达具有量效关系和时效性关系；
AQP5蛋白及基因表达显著下降，与肺水肿的形成相一致，提示肺损伤后AQP5表达下调与肺泡上皮液体转运功能降低有关，可能是导致肺泡水肿形成的重要因素之一。

辐射后，肺水肿发生可能与VEGF、AQP5共同的作用、相互促进有关[16]。VEGF水平会升高并引起高渗透肺水肿。AQP5位于器官细胞膜表面，可参与水转运及腺体分泌，属于肺泡上皮细胞分化的重要标志，当肺泡Ι型上皮细胞受损时，AQP5水平会明显升高，本研究为为辐射防护提供一定的资料，仍需继续深入研究，深层次探究辐射性肺水肿的发生、发展机制。

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