圆齿野鸦椿两种色原酮碳苷化合物生物合成相关基因筛选与分析

向 双, 孙维红, 乐易迅, 陈德强, 邹双全

(1.福建农林大学林学院；
2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

色原酮及其苷类化合物是一种天然次级代谢产物，具有多种生物活性和药理作用，如生物保护、植物染色、抗炎抗菌、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等[1].Biflorin中文名为5,7-二羟基-2-甲基-色原酮-6-c-β-d-葡萄糖苷；
isbiflorin中文名为5,7-二羟基-2-甲基-色原酮-8-c-β-d-葡萄糖苷.研究表明，色原酮碳苷biflorin和isobiflorin具有很强的抗炎活性[2,3]，15 mg·kg-1剂量的效果相当于阳性对照药物布洛芬100 mg·kg-1剂量的效果[3]，活性约为布洛芬的6.7倍.此外，biflorin和isobiflorin是强大的细胞毒性药物，可以影响细胞存活、克隆原性和活动性，从而抑制癌症的发生[4].Biflorin和isobiflorin已经从许多植物中分离得到，包括粗茎鳞毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)[5]、全能花(Pancratiumbiflorum)[6]和丁香(Syzygiumaromaticum)[7]，其中丁香中含量最高，达1.5 mg·g-1.其他植物中的含量较低，导致色原酮碳苷开发利用价值较低.

近年来，转录组研究已成为鉴定植物代谢途径中功能基因的广泛应用方法.许多类型化合物的生物合成途径，如黄酮类化合物[8]、三萜类化合物[9]和甾体皂苷类化合物[10]都已通过转录组学研究得以解析.然而biflorin和isobiflorin的生物合成研究相对匮乏，目前，仅对芦荟biflorin和isobiflorin的合成途径进行了研究[11].植物Ⅲ型酮类聚合酶(PCS)催化丙二酰辅酶A合成色原酮—5，7-二羟基-2-甲基色原酮，然后在糖基转移酶(UGT)的作用下形成各种不同类型的色原酮化合物.

圆齿野鸦椿(Euscaphiskonishii)属于省沽油科(Staphyleaceae)，是我国广泛种植的传统民间药用和观赏植物[12,13].研究表明[14]圆齿野鸦椿果皮中上述两种色原酮碳苷类化合物的含量为9.46 mg·g-1，是丁香含量的6.3倍，而且在不同部位的含量存在显著差异.本试验基于转录组测序对biflorin和isobiflorin的生物合成相关基因进行了鉴定与筛选，分析其表达情况，并对6-CUGT基因和8-CUGT基因进行了区分，利用qRT-PCR分析验证转录组数据的准确性.以期为圆齿野鸦椿不同品种的选育和种质资源的利用提供依据.

1.1 材料

圆齿野鸦椿种植于福建农林大学科技园，树龄6年，于2018年10月采集圆齿野鸦椿叶片、枝条和果皮样品，分别装袋标记，带回实验室荫晾，然后在50 ℃烘干粉碎，用于色原酮碳苷含量测定.另一部分样品采集完后，立即用清水洗净，滤纸擦干，用5 mL冻存管收集并做好标记，立即放入液氮中，后转至-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取及转录组分析，每个组织部位取3个重复.

1.2 方法

1.2.1 色原酮碳苷含量测定 采用HPLC指纹图谱法测定圆齿野鸦椿色原酮碳苷含量，具体参照倪林等[14]的测定方法.

1.2.2 转录组测序及组装 使用天根植物提取试剂盒(参照试剂盒步骤说明)提取圆齿野鸦椿枝条、叶片和果皮的RNA.使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific, USA)对所得圆齿野鸦椿RNA样品的纯度和浓度进行检测，并利用Agilent Bioanalyzer 2100检测其浓度和完整性.

利用First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)制备cDNA，具体步骤及反应体系参考试剂盒说明.将cDNA片段末端修复，构建圆齿野鸦椿转录组数据库.检测结果合格的cDNA文库利用DNBSEQ高通量测序平台测序，并用Trinity软件组装测序数据.

1.2.3 功能注释 利用BLAST[15]软件将Unigene序列与COG[19]、GO[18]、KEGG[22]、KOG[20]、Swiss-Prot[17]、eggNOG4.5[21]、NR[16]数据库比对，利用KOBAS2.0[23]获取unigenes在KEGG中的KEGG Orthology结果，对unigenes的氨基酸序列进行预测，并利用HMMER[24]软件与Pfam[25]数据库比对，从而得到unigenes的注释结果.

1.2.4 差异基因鉴定 利用Bowtie[26]将圆齿野鸦椿测序得到的Reads与unigenes进行比对，并利用RSEM[27]进行表达量水平预估.利用FPKM值表示unigenes的表达丰度.使用DESeq[28]分析样品组间的差异表达情况，得到两个样品之间的差异表达基因集.

1.2.5 系统发育分析 利用TBTOOL软件的MUSCLE工具(http://www.drive5.com/muscle/)进行多序列比对，然后利用数据集构建N-J系统发育树.进行1 000次bootstrap抽样，其它参数为默认值.参考蛋白质序列(GtUF6CGT1、TcCGT1和PlUGT43)下载自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

1.2.6 qRT-PCR分析 使用天根试剂盒提取样品总RNA并进行电泳检测.以提取的RNA为模板，按 TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书配制RT反应液，总反应体系20 μL：42 ℃孵育15 min，85 ℃灭活5 s，得到cDNA，-20 ℃保存.将稀释5倍的cDNA作为qRT-PCR的模板，配制反应液，总反应体系20 μL：qRT-PCR反应条件为：94 ℃ 30 s；
94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；
72 ℃ 10 s；
95 ℃ 15 s；
60 ℃ 1 min；
95 ℃ 1 s.使用EkGADPH作为内参基因，检测各目的基因在样本中的相对表达量.

2.1 不同部位biflorin和isobiflorin含量差异

biflorin和isobiflorin在圆齿野鸦椿不同组织部位中的含量表现为果皮最高，叶片次之，枝条最低，且差异显著(P<0.05).其中，果皮中biflorin和isobiflorin含量分别为5.073 4和4.388 4 mg·g-1，叶片中biflorin和isobiflorin含量分别为2.398 2和1.786 1 mg·g-1，而在枝条中biflorin和isobiflorin含量分别为0.521 6和0.495 3 mg·g-1(表1).

表1 圆齿野鸦椿不同部位的biflorin和isobiflorin含量1)Table 1 Contents of biflorin and isobiflorin in different tissues of E.konishii

2.2 测序及组装结果

通过转录组测序分别从叶片、枝条、果皮中获得91 768 881、100 363 012和100 124 694个高质量读段，GC含量分别为45.13%、45.62%和45.10%(表2).利用Trinity软件进行组装之后共获得了85 342个unigenes，总长度为76 934 761 bp，平均长度为893.60 bp，N50长度为1 307 nt，长度超过1 000 bp的unigenes有22 477个，占比26.34%，表明序列完整性较高，可用于功能注释.

表2 转录组组装数据Table 2 Data of transcriptome assembly

2.3 Unigenes功能注释

对圆齿野鸦椿转录组unigenes功能进行注释(表3)，在85 342个unigenes中，共有40 218个unigenes被注释到1个或多个数据库.注释到NR数据库的unigenes数最多，有39 074个，占比45.79%.其次是注释到eggNOG4.5数据库的unigenes有37 241个，占比43.64%.注释到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot数据库的unigenes数分别为11 713、23 899、14 291、22 551、25 124和24 234个，分别占比13.72%、28.00%、16.75%、26.42%、29.44%和28.40%.

表3 圆齿野鸦椿unigenes功能注释Table 3 Function annotation of unigenes in E.konishii

2.4 不同组织间差异基因KEGG富集分析

圆齿野鸦椿叶片、枝条和果实3个组织中的差异基因主要富集在21条KEGG代谢通路中(图1).其中，枝/叶间的差异基因富集在植物激素信号转导中最多(66个)，其次是淀粉和蔗糖代谢(55个).叶/果皮中的差异基因富集在苯丙素生物合成中最多(40个).枝/果皮间的差异基因富集在植物激素信号转导中最多(61个).并且，异黄酮生物合成，半乳糖代谢、光合作用的碳固定，泛素酮和其他萜醌生物合成，异喹啉生物碱生物合成，托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、戊糖、葡萄糖醛酸转换只有叶/果皮或枝/果皮间的差异基因富集，没有枝/叶间的差异基因富集.这些基因可能为果皮中特异表达基因.

图1 不同组织间差异基因KEGG富集分析Fig.1 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes among different tissues

2.5 Biflorin和isobiflorin合成候选基因筛选及分析

2.5.1 Biflorin和isobiflorin合成候选基因筛选 植物Ⅲ型酮类聚合酶(PCS)催化丙二酰辅酶A合成色原酮—5，7-二羟基-2-甲基色原酮，然后在糖基转移酶的作用下形成各种不同类型的色原酮化合物[11].但在圆齿野鸦椿的转录组数据中并未注释到PCS基因，而该酶基因属于查尔酮合成酶家族(CHS).基于此，将转录组数据中注释的CHS基因与PCS基因进行序列比对与系统进化树分析(图2a)，基因Ej19428与MedicagosativaPCS属同源基因序列，可能扮演相同的功能.在CHS基因中，Ej08012表达相对较高(图2b).另外，从差异基因中筛选出7个差异表达的糖基转移酶UGT基因，这些基因可能参与isobiflorin和biflorin的合成.

a.PCS同源基因分析;b.PCS同源基因表达热图;c.UGT基因系统进化树;d.biforin和isobiforin结构;e.UGT基因表达热图.热图中数值为标准化后的Z-SCORE，红色越深表示基因表达量越高，蓝色越深表示基因表达量越低.图2 biflorin和isobiflorin生物合成相关基因分析Fig.2 Analysis of genes related to biosynthesis of biflorin and isobiflorin

2.5.2UGT基因分类与表达分析 糖基转移酶可在6位或8位C原子的位置发生取代，在6位C取代产生biflorin，在8位C取代则生成isobiflorin(图2d)[11].为了区分6-CUGT和8-CUGT，将7个UGT基因与已知的6-CUGT(GtUF6CGT1)和8-CUGT(TcCGT1,PlUGT43)构建系统发育树(图2c).结果表明，Ej26841、Ej26842、Ej04721和Ej27609是6-CUGT，Ej29043、Ej29870和Ej19518是8-CUGT.因此，4个6-CUGT基因可能与bibiflorin的生物合成途径有关，3个8-CUGT基因可能与isobiflorin的生物合成有关.

6-CUGT基因和8-CUGT基因的表达模式不同(图2e).6-CUGT在果皮中表达量最高，枝叶中较低，且biflorin的含量在果皮中也为最高，与UGT基因表达一致.8-CUGT在叶片中表达量最高，果皮次之.但isobiflorin的含量在果皮中最高，与UGT基因表达情况存在差异.

2.5.3 qRT-PCR分析 为了进一步验证转录组数据的准确性，对筛选出的基因进行qRT-PCR分析(图3).果皮中的Ej19428基因相对表达量高于枝和叶，6-CUGT基因在果皮中最高，枝和叶相对较低，8-CUGT基因相对表达量在叶片中最高，果皮和枝中低于叶.qRT-PCR结果与转录组数据呈现一致的表达模式，证明转录组数据可靠.

图3 biflorin和isobiflorin生物合成相关基因qRT-PCR分析Fig.3 qRT-PCR analysis of genes related to biosynthesis of biflorin and isobiflorin

圆齿野鸦椿作为我国传统中药材，其果皮内色原酮碳苷含量高达现有植物6.3倍，极具开发潜力.本研究利用高通量测序平台对圆齿野鸦椿叶片、枝条、果皮进行转录组测序，为色原酮碳苷biflorin和isobiflorin合成相关基因的筛选提供了依据.

根据KEGG富集分析结果，不同组织间的差异基因主要富集在21条KEGG代谢通路，且不同组织间的差异基因富集情况存在差异.圆齿野鸦椿类黄酮含量在叶片中最高[29]，富集在类黄酮生物合成的差异基因来自叶/果皮以及叶/枝，这些基因可能主要在叶片中特异性表达，影响叶片中类黄酮的含量；
果皮中多糖(含半乳糖)含量较高[30]，只有枝/果皮间的差异基因富集在半乳糖代谢，这些基因可能主要在果皮中特异性表达.因此推测Biflorin和isobiflorin含量在圆齿野鸦椿果皮中最高，也与果皮中特异性表达的基因有关.

糖基化是生物体中最为重要的生物反应之一，其在糖基转移酶的催化作用下将糖基从活化的供体分子转移到受体分子[31].糖基的取代位置不同生成的碳苷化合物也不同，如糖基在6位C取代产生biflorin，在8位C取代则生成isobiflorin[11].从圆齿野鸦椿转录组数据中筛选出7个差异表达的糖基转移酶UGT基因，通过与已知的6-CUGT(GtUF6CGT1)和8-CUGT(TcCGT1,PlUGT43)构建系统发育树，将7个UGT基因区分为4个6-CUGT和3个8-CUGT.表达分析结果表明，6-CUGT和8-CUGT基因的表达模式不同，6-CUGT在果皮中表达量最高，枝叶中较低，且biflorin的含量在果皮中也为最高，与UGT基因表达一致.这说明biflorin的含量与4个6-CUGT基因的表达水平有关.8-CUGT在叶片中表达水平最高，果皮次之.但isobiflorin的含量在果皮中最高，与UGT基因表达情况存在差异，这可能与圆齿野鸦椿中丰富的碳苷类化合物有关[32].也可能是由于isobiflorin的合成初始发生在叶片中，后储存于果皮，这类似于皂苷生物合成初始发生在叶片，储存部位在根部[33,34].具体原因如何，还有待进一步验证和功能分析.

本研究初步筛选和分析了圆齿野鸦椿色原酮碳苷化合物生物合成相关基因，有助于圆齿野鸦椿资源的筛选和培育，以及圆齿野鸦椿药用价值的开发和利用.

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