茯砖茶中冠突散囊菌的检测条件研究

刘 静，舒 静，秦 婧

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

茯砖茶隶属中国茶叶六大分类中的黑茶，目前盛产于陕西省泾阳县和湖南省安化县，其中泾阳是茯砖茶的发源地，于1368年前后形成定型的泾阳茯砖茶，如今更是陕西泾阳县的地理标志产品[1]。

茯砖茶在发花过程中，通过控制一定的温湿度，促进优势菌种的生长，产生大量的金黄色的闭囊壳，俗称“金花”，“金花”的多少是鉴别茯砖茶品质好坏的标准[2]。研究表明，“金花”在茯砖茶中繁殖时会产生大量的酶类，这些酶使原料中的纤维素、果胶质、淀粉、蛋白质、脂肪和多酚等物质分解，对改善茯砖茶的品质有着积极的作用[3]。多数学者都对茯砖茶发花中的优势菌进行鉴定，认为冠突散囊菌是优势菌[4-7]。2012年，丁婷等[8]也研究证明了陕西泾阳茯砖茶中优势菌为冠突散囊菌。

检测茯砖茶中的冠突散囊菌不仅可以评价茶叶质量，更能促进茯砖茶的良好发展，因此对冠突散囊菌进行检测至关重要。现行的茯砖茶标准中提及冠突散囊菌的主要有《紧压茶 第3部分：茯砖茶》（GB/T 9833.3—2013）[9]和《紧压茶 第3部分：茯砖茶》（DBS 61/0006—2014）[10]，其中所指定的检测方法均为《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）[11]，这个标准规定了食品中霉菌和酵母的计数方法，其中第一法适用于各类食品中霉菌和酵母的计数，第二法适用于番茄酱罐头、番茄汁中霉菌的计数；
对于冠突散囊菌的检测并未作出详细规定。本文针对GB 4789.15—2016中的第一法-平板计数法对冠突散囊菌的检测细节条件进行研究。

1.1 材料与设备

15份茯砖茶，购自陕西各超市卖场；
孟加拉红琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司；
霉菌培养箱；
生物安全柜；
拍击式均质器；
涡旋混匀仪。

1.2 方法

1.2.1 试验方案

为了能够做到均衡取样，取样方法选择中心五点法和对角线五点法进行比较研究，其中中心五点法是在对茯砖茶的两条对角线作四等分，分割点即为取样点，对角线五点法则是对茯砖茶的其中一条对角线进行六等分，同样，分割点即为取样点；
中心五点法[12]示例见图1，对角线五点法示例见图2。除了要考虑均衡取样，所有样本的均质时间也应当保持一致，均质时间选择15 s、30 s、60 s进行比较研究，从而选择出既能节省试验时间又能充分均质样品的均质时间。

图1 中心五点法示例

图2 对角线五点法示例

1.2.2 试验方法

本次研究对共计15份茯砖茶样本按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB4789.15—2016）第一法 霉菌和酵母平板计数法进行检验。秤取25 g样品，加入225 mL无菌生理盐水，用拍击式均质器均质拍打，制成1∶10的样品匀液。取1 mL 1∶10的样品匀液注入一支含有9 mL的无菌生理盐水的试管中，用涡旋混匀仪混均后制成1∶100的样品匀液，若有需要，可重复上述步骤继续稀释。选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍梯度稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液分别加入2个无菌平皿中，同时分别吸取1 mL无菌生理盐水加入两个无菌平皿作为空白对照，及时将20～25 mL冷却至46 ℃左右的孟加拉红琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，置于水平台面待培养基完全凝固后置于培养箱内（28±1）℃培养，观察并记录至第5天的结果。

2.1 取样方法比较

对每一份样本都称取两份试验样本，一份按照中心五点法取样，一份按照对角线五点法进行取样，每个取样点取样约5 g，总计25 g，进行标注后加入无菌生理盐水进行10倍稀释，所有样本均质60 s后按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）第一法 霉菌和酵母平板计数法进行检验，菌落计数时，用肉眼观察计数，冠突散囊菌在孟加拉红琼脂平板上生长形态为圆形、边缘白色至鹅黄色、中心呈黄褐色、绒毛状，也有未生长大的菌落为小的白色绒毛状菌落。选择计数结果在10～150 CFU的稀释度，用平均数乘以相应的稀释倍数即可。最终统计结果见表1。

表1 不同取样方法的结果统计

由表1知，中心五点法取样所测得的数据均比对角线五点法取样所测得的数据大，原因可能是中心五点法的取样点位置均为茯砖茶的较为中间的部位，其冠突散囊菌分布相对均匀，而对角线五点法取样位置中有两个取样点比较靠近茯砖茶边缘的部位，而边缘部分的冠突散囊菌一般分布较少，相较而言，中心五点法更能代表样品的真实情况。

2.2 均质时间比较

对中心五点法的试验样本先均质15 s后按照标准要求，取出1 mL直接进行梯度稀释并选适宜的稀释度进行试验，剩余的样本继续均质15 s后再次按照标准要求，取出1 mL直接进行梯度稀释并选适宜的稀释度进行试验，最后剩余样本继续均质30 s后同样按照标准要求，取出1 mL直接进行梯度稀释并选适宜的稀释度进行试验，最终得到的3份试验样本，即均质时间分别为15 s、30 s、60 s的试验样本。对所有试验样本按照标准进行检测后，观察计数后计算结果。结果统计见表2。

表2 不同均质时间的结果统计

由表2知，随着拍击时间的延长，所测得的冠突散囊菌数据也越来越大。均质15～30 s时，数据增幅较大，而30～60 s的数据增幅较为平缓，原因可能是15s拍击时间过短，很多茶叶样本还没有得到充分的均质，冠突散囊菌没有释放至样品匀液中，30 s时大多数茶叶样本得到充分均质，从而释放更多的冠突散囊菌至样品均液中，60 s时拍击时间长，茶叶样本得到充分的均质，冠突散囊菌的释放也逐步达到顶点；
拍击时间大于1 min时数据或许仍会有所增加，但考虑到总试验时间不能过长、霉菌孢子容易扩散等因素，拍击时间不宜超过1 min。

本次研究立足陕西特色产品的检验，结合实际工作经验，依据现有标准对陕西泾阳茯砖茶中冠突散囊菌的检测条件进行研究分析，分析结果显示中心五点取样法较对角线五点取样法测得的数据更大，更能代表样本的真实情况，且随着拍击时间的增长，所测得的数据也会增加，但最终会趋于稳定，但考虑到总实验时间不宜过长，孢子容易扩散等因素，均质时间不宜超过1 min。此次研究虽然样本量采集远远不够，且很多其他条件尚未摸索，但能为后续实验条件的选择及研究提供一定的支撑。

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