外源褪黑素对铬胁迫下百日草种子萌发及幼苗生理特性的影响

朱红霞，李赛楠，苏文青，李小辉，张家洋

(1.新乡学院生命科学与基础医学学院，河南 新乡 453003；
2.新乡市金苑邦达富农业科技有限公司，河南 新乡 453003)

铬(Cr)是对人体毒害最大的五种重金属元素之一，主要以两种价态——Cr3+和Cr6+存在，其中，Cr6+对生态环境的影响尤为严重，可诱使生物体产生突变、癌变和畸变[1]，并可抑制植物种子萌发、降低生物量、破坏光合作用、打破活性氧代谢平衡、干扰养分吸收及转运等，严重时会导致植物死亡[2，3]。

褪黑素(melatonin，MT)即N-乙酰基-5-甲氧基色胺，属于吲哚类色胺，广泛存在于动植物体内。MT不仅对植物生长过程具有良好的调控能力，而且对各种不良环境因素造成的伤害也有一定的抵御作用，能够使植物对低温、干旱、高盐、重金属胁迫等逆境的抵抗力得以增强[4]。目前已知MT可通过激发抗氧化酶系统清除氧自由基，间接促进次生代谢产物的合成，修饰细胞壁，从而减轻细胞损伤，缓解植物重金属胁迫[5]。如镍(Ni)胁迫下添加MT可明显促进水稻(Oryza sativa)幼苗根系生长，降低O2·-产生速率，提高可溶性蛋白含量[6]。砷(As)胁迫下，外源MT能够提高水稻种子萌发能力、幼芽抗氧化酶活性和根系活力，减轻膜脂过氧化损害[7]。镉(Cd)胁迫下，MT处理能提高大头菜(Brassica junceavar.megarrhiza)幼苗的光合色素含量，降低各器官Cd积累[8]；
提高萝卜(Raphanus sativusL.)叶片抗氧化酶活性，降低活性氧积累，缓解氧化胁迫[9]；
通过提高抗氧化防御能力，增强油菜(Brassica napusL.)对Cr的抗逆性[10]。

百日草(Zinnia elegans)为菊科一年生草本花卉[11]。花色艳丽、株型美观、花期长、观赏价值高，是园林绿化的常用花卉。目前，对百日草的研究主要集中在栽培应用等方面，施加外源物质调控耐重金属Cr胁迫的研究较少，MT对抗性的调控在园林植物中应用的报道也不多见。因此，本试验研究了施加不同浓度外源MT对Cr胁迫下百日草种子萌发和幼苗生理的影响，旨在为缓解重金属胁迫对植物的毒害研究提供一定的理论依据。

1.1 试验材料

试验于2021年9—11月在河南新乡学院植物生态实验室和植物组织培养实验室内进行。供试百日草品种为‘梦境’，购自青岛黄泷种子有限公司。供试外源MT(分析纯，纯度99%)，南京都莱生物技术有限公司。供试Cr胁迫试剂为重铬酸钾(K2Cr2O7，分析纯)，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 种子萌发试验 2021年9月初对百日草种子Cr敏感度进行了前期试验，结果表明用100μmol/L K2Cr2O7处理后，其根长仅约为对照的1/4，受到了较大程度伤害但不致死，因而确定本试验最适Cr胁迫浓度为100 μmol/L。

2021年9月25日，选取整齐度一致、籽粒完整且品质好的百日草种子，先用自来水洗去表面杂质，然后用10%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗后温水(28℃)浸泡12 h。在每个铺有2层滤纸的培养皿(φ＝90 mm)中摆放浸泡好的百日草种子50粒，分别加入10 mL含有不同浓度Cr和MT的处理液。试验设7个处理，具体见表1，每个处理重复4次。将所有培养皿置于温度25℃、相对湿度75%、14 h光照/10 h黑暗、光照强度为500 μmol/(m2·s)的环境中培养，并以称重法增补水分以维持处理液浓度基本恒定。以胚根突破种皮1 mm视为有效萌发，每天定时记录种子萌发情况，连续培养7 d。

表1 各处理MT和Cr浓度 (μmol/L)

依据《国际种子检验规程》[12]，分别于第4天和第7天统计发芽势和发芽率:

式中:Gt指t日内发芽数，Dt指相应发芽天数，S指萌发第7天幼苗的长度。

1.2.2 幼苗培养试验 2021年10月15日开始进行幼苗生长试验。种子消毒方法同1.2.1。消毒后将百日草种子均匀播种于装有灭过菌的珍珠岩育苗钵(直径18 cm，高16 cm)内，前期每天用适量蒸馏水浇灌，出苗7 d后间苗，每盆留长势一致、分布整齐的幼苗20株，换1/2剂量的Hoagland营养液进行培养，待幼苗长至10 cm左右进行试验处理。将K2Cr2O7用1/2Hoagland营养液配制成Cr浓度为100 μmol/L的溶液对幼苗进行浇灌，将MT配制成浓度分别为0、50、100、200、400、600 μmol/L的溶液进行叶面喷施。试验设7个处理，同表1，每个处理30钵。CK1从处理之日起每3 d在百日草叶面喷洒蒸馏水1次至叶面全湿，有液珠滴落为止，并在处理当日向营养钵中浇灌1/2Hoagland营养液20 mL，处理第7天再次浇灌1/2Hoagland营养液20 mL；
CK2从处理之日起每3 d在百日草叶面喷洒蒸馏水1次至叶面全湿，有液珠滴落为止，在处理当日和第7天向营养钵中分别浇灌100 μmol/L Cr胁迫溶液20 mL；
T1—T5从处理之日起每3 d在百日草叶面喷洒相应浓度的MT溶液1次至叶面全湿，有液珠滴落为止，并在处理当日浇灌100 μmol/L Cr胁迫溶液20 mL，处理第7天再次浇灌100 μmol/L Cr胁迫溶液20 mL。第14天收样，选取生长同部位的叶片测定各生理指标。

可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定参照陈建勋[13]的方法；
叶绿素含量采用80%丙酮浸提法测定[14]；
丙二醛(MDA)含量的测定参照寇江涛等[15]的方法；
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照高俊凤[16]的方法。

1.3 数据处理

运用Microsoft Excel 2010进行数据整理与绘图，SPSS 22.0进行数据分析，用ANOVA和LSD法进行单因素方差分析和多重比较。

2.1 外源MT对Cr胁迫下百日草种子萌发的影响

从表2可以看出，与CK1相比，Cr胁迫(CK2)显著抑制了百日草种子萌发(P＜0.05)，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别降低25.94%、30.12%、32.21%和47.28%。Cr胁迫下喷施不同浓度MT后，随MT浓度的增加各萌发指标呈先升高后降低的规律。T1、T2、T3和T4处理对Cr胁迫下百日草种子萌发有显著促进作用(P＜0.05)，其中T2处理效果最佳，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数较CK2分别升高27.42%、37.35%、46.39%和82.63%。随着MT浓度的进一步升高，T3和T4处理的促进作用明显下降，T5处理各指标与CK2不存在显著差异(P＞0.05)。

表2 外源MT对Cr胁迫下百日草种子萌发的影响

2.2 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量的影响

如图1所示，与CK1相比，Cr胁迫(CK2)下百日草幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白含量均显著升高(P＜0.05)，分别升高了14.27%和20.34%。与CK2相比，各喷施外源MT处理的可溶性糖、可溶性蛋白含量均明显升高，除T5处理下可溶性糖含量差异不显著外，其他处理差异均达显著水平(P＜0.05)，且均在T2处理下达到最大值，较CK2分别升高49.53%和54.14%，此后随MT浓度的继续升高呈降低趋势。表明适宜浓度的MT在一定程度上可以提高Cr胁迫下百日草幼苗的渗透调节能力，增强对Cr胁迫的抗性。

图1 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影响

2.3 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗叶绿素含量的影响

由表3可见，与CK1相比，Cr胁迫(CK2)处理下百日草幼苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量显著下降(P＜0.05)，分别降低39.49%、54.35%和43.67%。施加MT后，随MT浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量呈先升后降趋势，均在T2处理时达到最大值，较CK2分别升高62.91%、136.50%和79.71%；
但继续升高MT浓度对Cr胁迫的缓解作用逐渐减弱，百日草幼苗叶绿素含量下降，但仍均显著高于CK2。表明喷施外源MT可缓解Cr胁迫对百日草幼苗光合色素积累的损害。

表3 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗叶绿素含量的影响 (mg/g)

2.4 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗MDA含量的影响

由图2可知，Cr胁迫(CK2)处理下百日草幼苗MDA含量达到最大值，与CK1相比显著增加1.13倍(P＜0.05)。施加不同浓度MT后，MDA含量随MT浓度的增加呈先下降后上升的趋势，但均显著低于CK2，在MT浓度为100 μmol/L(T2)时达到最小值，和CK2相比降低49.49%，与CK1无显著差异(P＞0.05)。当MT浓度高于100 μmol/L时，MDA含量逐渐升高，对Cr胁迫造成氧化损伤的缓解作用逐渐减弱。

图2 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗MDA含量的影响

2.5 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗抗氧化酶活性的影响

由图3可以看出，与CK1相比，单一Cr胁迫处理(CK2)明显降低了百日草幼苗的抗氧化酶活性，SOD和CAT活性分别降低16.71%和12.25%，差异显著；
POD活性降低16.71%，但差异不显著。施加不同浓度MT后，与CK2相比，百日草幼苗SOD、POD和CAT活性显著升高(P＜0.05)，且三种酶活性均在T2处理下达到最大值，分别升高43.89%、119.95%和65.49%；
此后随MT浓度继续升高，抗氧化酶活性逐渐降低，高浓度MT(T5)作用下，SOD活性与CK1无显著差异，而POD和CAT显著高于CK1。

图3 外源MT对Cr胁迫下百日草幼苗SOD(A)、POD(B)和CAT(C)活性的影响

Cr是一种重金属污染物，高浓度Cr胁迫可以抑制植物细胞分裂，影响根系对有机物质的吸收，导致植物叶片发黄，光合作用降低，生物量减少[17]。种子萌发时对Cr十分敏感，高浓度Cr胁迫会使植物种子内糖和蛋白质等生理代谢发生紊乱，活性氧增多，膜脂过氧化加重，种子萌发受到抑制[18]。MT作为一种重要的植物生长调节物质，能够增强植物对干旱、高温和重金属等非生物胁迫的抗性[19]，促进种子内球蛋白和微管微丝的合成，增强乙醛酸循环中相关酶的活性，进而促进细胞分裂，并为种子萌发提供能量[20]。本研究中，100 μmol/L Cr胁迫下，百日草种子萌发受到显著抑制，而施加50～400 μmol/L外源MT对百日草种子的萌发有明显的促进作用，且在100 μmol/L时缓解效果最优；
但当MT浓度升高到600 μmol/L时促进作用不明显。这与黄益宗等[7]对水稻种子在As胁迫下施加MT的研究结果基本一致。

植物在重金属胁迫下自身能发生适应性反应，组织细胞内会合成和积累大量可溶性糖及可溶性蛋白等渗透调节物质，以维持细胞内的渗透势[21]。唐懿等[22]研究表明，MT处理可显著提高Cd胁迫下豌豆幼苗可溶性蛋白含量。本研究中，单一Cr胁迫下，百日草幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量有所升高，可能是由于百日草为应对胁迫启动了自我保护机制，促进了可溶性糖的积累和蛋白质的合成；
施加不同浓度MT后，可溶性糖和可溶性蛋白含量进一步显著升高，说明MT增强了这种保护机制，并以100 μmol/L MT处理效果最佳。表明适宜浓度的MT处理可以通过提高可溶性糖和可溶性蛋白含量，维持细胞内的渗透平衡，缓解Cr胁迫对百日草的伤害。

重金属胁迫会抑制叶绿素酸酯还原酶的活性，破坏叶绿体膜结构，导致光合作用效率降低，植物生长受到影响[23]。本研究发现，Cr胁迫下百日草幼苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著降低，而施加不同浓度MT后均显著升高。MT对Cr胁迫的缓解作用可能与其能防止叶绿素的降解有关[24]，也可能与其减弱了重金属对叶绿素酸酯还原酶的抑制作用、为叶绿体膜结构提供了保护、增强了有机物的吸收能力、活化了光合反应相关酶类有关[22]。表明适宜浓度MT处理能够提高百日草幼苗叶绿素的含量，从而减轻Cr胁迫的毒害，促进植株正常生长。

植物处于重金属胁迫时，细胞内活性氧产生与清除之间的平衡被打破，大量自由基积累会引起膜脂过氧化，MDA是膜脂过氧化的产物之一，其含量高低表征膜脂过氧化程度[25]。植物体自身的SOD、POD和CAT等抗氧化保护酶类，能清除胁迫产生的活性氧，从而减轻植物受到的伤害[26]。本研究表明，Cr胁迫下，百日草幼苗的MDA显著积累，而外源MT处理显著抑制了MDA的积累，缓解了膜脂过氧化程度，维持了细胞膜的稳定性，提高了对重金属Cr胁迫的抵抗能力；
50～400 μmol/L MT处理显著提高了Cr胁迫下百日草幼苗的SOD、POD和CAT活性，并以100 μmol/L MT处理效果最佳。这与蒋航等[27]对水稻的研究结果大致相似。

综上所述，100 μmol/L Cr处理对百日草种子萌发和幼苗生长造成了严重的抑制作用。适宜浓度的外源MT能够通过增强百日草幼苗的抗氧化酶活性提高对活性氧和自由基的清除能力，降低膜脂过氧化对细胞膜系统的伤害，有效抑制叶绿素降解酶活性，提高叶绿素含量，从而缓解重金属铬胁迫带来的伤害，促进百日草种子萌发及幼苗的生长，且以100 μmol/L MT处理缓解效果最佳。

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