基于网络药理学研究二仙汤加减方治疗脊髓损伤的作用机制

李二亮 晏荣保 闫 康 赵宁侠 黄汝芹 马 琼 赵海恩 廖 博

(1 空军军医大学第二附属医院骨科，西安，710038；
2 空军军医大学第二附属医院中医科，西安，710038)

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)指由各种原因导致椎管内神经结构(包括脊髓和神经根)及其功能的损害，出现损伤水平及以下脊髓功能(运动、感觉、反射等)障碍，是脊柱骨折的严重并发症[1]。脊髓损伤根据不同的损伤平面会出现相应的神经功能障碍，如呼吸肌麻痹，大小便失禁等症状，严重者可引起不同程度的截瘫，甚至会危及生命[2]。相关研究显示，我国SCI年患病率为37/100万，年龄34.7～54.4岁，男性高于女性，汽车碰撞和高空坠落是SCI的主要原因[3]。尽管创伤性SCI患者的生存率随着时间的推移而改善，但患者的病死率仍然超过年龄匹配的对照组[4]。目前关于创伤性脊髓损伤的治疗主要包括早期手术治疗、高压氧治疗、针灸治疗、中国传统药物治疗等[5-11]。

二仙汤由仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏、知母组成，是20世纪50年代初张伯纳研制的著名中药方剂，用于治疗骨质疏松症已有几十年的历史[12]。桃红四物汤主要由6味中药组成，包括桃仁、红花、当归、川芎、白芍、熟地黄，记载于中国清代吴谦的《医宗金鉴》，用于促进血流，防止瘀血的发生，也已广泛应用于骨关节炎的治疗[13-14]。我院总结长期临床经验，在传统中药制剂二仙汤以及桃红四物汤的基础上进行适当的加减，增加了黄芪、延胡索、郁金、香附、陈皮、山药、丹参，构建二仙汤加减中药方剂用于临床治疗SCI。该方由18味中药组成：仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏、知母、桃仁、红花、熟地黄、白芍、川芎、黄芪、延胡索、郁金、香附、陈皮、山药、丹参。见表1。虽然二仙汤加减目前已应用于促进脊髓损伤患者术后功能恢复等方面，然而该方在脊髓损伤术后治疗中的作用机制尚不明确。

中药网络药理学通过网络生物学、化学信息学、药理学和生物信息学等多学科交叉，从整体视角出发，发现药物和机体的复杂相互作用，为中药复方作用机制的研究提供了有效工具和新的视角[15]。本研究结合网络药理学和实验研究，探究二仙汤加减治疗脊髓损伤的相关机制。

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级Wistar雌性大鼠(斯贝福生物技术有限公司，合格证编号：No.110324200104595445)，动物房保持12 h/12 h昼夜交替，保持动物自由饮水、进食，温度23～25 ℃，湿度62%，适应性饲养1周后进入实验。

1.1.2 药物 二仙汤加减药物组成为：仙茅10 g、淫羊藿30 g、巴戟天10 g、当归10 g、黄柏12 g、知母10 g、桃仁10 g、红花10 g、熟地黄24 g、白芍30 g、川芎9 g、黄芪40 g、延胡索15 g、郁金12 g、香附12 g、陈皮10 g、山药20 g、丹参9 g。中药方剂来源于本院中医科(华润三九配方颗粒，批号：2101004S)；
戊巴比妥钠(默克公司，德国，批号：P11012)，5%复方利多卡因乳膏(同方药业集团有限公司，批号：2012122)，注射用头孢唑林钠(四川制药制剂有限公司，批号：210101B)。

1.1.3 试剂与设备 4%通用型组织固定液(中性)(中晖赫彩生物医药科技公司，批号：BA1102)；
氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司，批号：2107032831)；
脊髓损伤模型打击器(北京金源科创科技有限公司，型号：ZH-ZYQ)；
4-0缝线(强生医疗器材有限公司，批号：21454605)。

1.2 方法

1.2.1 SCI模型制备 使用戊巴比妥钠腹腔麻醉8周SPF级Wistar雌性大鼠，在胸椎节段(T9)进行椎板切除术，直至脊髓从一侧到另一侧完全暴露，利用脊髓损伤模型打击器参照Allens法从50 mm高度进行脊髓打击，形成损伤组(50 mm损伤)，假手术组仅进行椎板切除而不进行脊髓打击，术后用4-0缝线分层缝合肌肉和皮肤，术后皮下给予注射用头孢唑林钠2 mL、5%复方利多卡因乳膏镇痛以及保温处理，如有膀胱功能障碍，每天行膀胱排空1次，直至恢复膀胱功能(图1A-F)。

图1 动物实验相关操作过程

脊髓损伤造模成功的标准：实验动物出现摆尾反射、双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪[21]。造模后对所有实验动物进行评分，损伤动物Basso、Beattie和 Bresnahan(BBB)运动评定量表评分≤2的实验动物被选用[22]。

1.2.2 分组和干预 将实验动物分为3组，中药组(50 mm损伤+药物)，对照组(50 mm损伤+水)，假手术组。中药组给予大鼠常规灌胃约2 mL(3 g合剂)二仙汤加减药液，对照组给予大鼠常规灌胃2 mL生理盐水，假手术组不做任何处理。

1.2.3 行为学评价及苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色 为评估SCI后肢功能行为学，通过BBB运动评定量表对大鼠进行评价，该量表用于评估关节运动、行走能力、躯干稳定性、肢体协调性、尾部位置和爪的精细运动。评分范围为21～0，分别表示运动正常和完全瘫痪。由两名分组设盲并接受充分培训的研究者对实验动物SCI前后进行BBB运动评定量表评分。如果2名研究者的评分不一致，则通过讨论确定共识评分。

HE染色：取脊髓损伤后第7天大鼠脊髓组织标本按标准HE染色技术处理。具体方法：用4%通用型组织固定液(中性)固定脊髓组织，在乙醇中脱水，然后包埋。随后对脊髓切片(3 μm)并进行HE染色，在光学显微镜下观察病理学改变。

1.2.4 构建二仙汤加减中药-中医症状-现代医学症状网络图 通过SymMap(https://www.symmap.org/)在线数据库获得二仙汤加减中药成分以及对应的中医症状、现代医学症状，构建网络图[17]。

1.2.5 中药成分挖掘 将二仙汤加减的18味中药材在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中进行挖掘，收集中药成分。以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18为标准进行相关成分筛选，得到中药活性成分集合[16]。

1.2.6 成分靶标筛选 活性成分进一步在TCMSP中挖掘其对应靶标，将筛选的靶标成分与Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库数据进行匹配，获得靶标基因。

1.2.7 SCI靶标基因筛选 分别以关键词“SCI”“Spine Cord Injure”“spine cord injure”在Genecards(https://www.genecards.org)，DrugBank(https://go.drugbank.com/)在线数据库检索相关基因，将获得的数据汇总后去重，得到SCI靶标基因。

1.2.8 构建药物疾病韦恩图 获得二仙汤加减中药靶标与SCI基因后，取二者的交集靶标基因，绘制韦恩图。

1.2.9 构建药物疾病交集靶标基因蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络 将二仙汤加减方与SCI的交集靶标基因输入到STRING在线数据库(https://string-db.org/)的Multiple proteins选项，Network type设置为full network，minimum required interaction score设置为medium confidence(0.400),得到PPI网络信息，再导入Cytoscape 3.7.1软件将PPI网络进行可视化处理。

1.2.10 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 将二仙汤加减与SCI的交集靶标基因输入到Metascape在线数据库(http://metascape.org/gp/index)，设定Min Overlap：3，P Value Cutoff：0.01，Min Enrichment：1.5.分别选择GO相关的数据库以及KEGG通路数据库，筛选相关数据导入生信云平台(http://www.ehbio.com)绘制气泡图。

2.1 有效作用靶点筛选 二仙汤加减中药-中医症状-现代医学症状网络图表明18味中药与SCI相关的中医症状共有21个，对应的现代医学症状为26个，其中相关性最高的前5个中药分别为川芎、当归、香附、丹参、延胡索；
中医症状和现代医学症状前10个为痛、肿痛、胀痛、跌扑肿痛、腰膝酸软、疼痛、牵扯痛、放射痛、灼烧痛、压迫痛。见图2。

图2 二仙汤加减方中药-中医症状-现代医学症状网络

2.2 动物实验结果 假手术组大鼠术后不同时间段BBB运动评定量表评分均为21分，说明单纯椎板开窗，对脊髓并未造成损伤。对照组大鼠在术后0 h至7 d出现双下肢完全瘫痪，BBB运动评定量表评分为0分，显示大鼠脊髓损伤并且在7 d内自愈效果较差；
而中药组在0～24 h下肢完全瘫痪，BBB运动评定量表评分为0分和对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。随着时间的推移(24 h至7 d)，中药组在大鼠可见明显逐渐恢复，在SCI后7 d时中药组BBB运动评定量表评分与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.019 8)。见图3。

图3 各组大鼠术前及术后BBB运动评定量表评分

HE染色结果显示，假手术组见正常大鼠脊髓组织(图4A)，对照组可见脊髓组织出现大片空洞(图中蓝色箭头所指)(图4B)，中药组可见脊髓组织大片空洞明显缩小(图中蓝色箭头所指)(图4C)，正常脊髓组织替代原有损伤区域。

图4 各组大鼠术后脊髓组织(HE染色，×40)

2.3 二仙汤加减方效应成分集构建 共检索到5 353个基因，去重筛选后共获得319个基因。

2.4 二仙汤加减治疗SCI效应成分靶标发现 从GeneCard数据库共检索到3 226个基因，DrugBank数据库共检索11个基因，合并去重后共获得2 638个基因，SCI与二仙汤加减交集基因216个(3.76%)。见图5。

图5 二仙汤加减靶标基因-脊髓损伤靶标基因韦恩图

2.5 二仙汤加减靶标和SCI疾病基因关联分析 结果表明，19种蛋白Degree值大于100，分别为AKT1、ALB、IL6、TP53、MAPK3、VEGFA、TNF、EGFR、CASP3、MAPK1、EGF、JUN、MAPK8、MYC、MMP9、ESR1、FOS、PTGS2、CXCL8。见图6。

图6 二仙汤加减-SCI蛋白靶点PPI网络

2.6 GO分析与KEGG通路分析 GO富集共有8 912个条目，其中生物学途径共有个6 712个条目，包括药物反应、凋亡过程负向调控、细胞增殖正向调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正向调控、血管生成正调控等。见图7A。633个条目与细胞组分有关，包括胞外间隙、神经元投射、线粒体外膜、受体复合物、线粒体、膜筏等。见图7B。1 034项与分子功能相关，包括酶结合、蛋白结合、相同蛋白结合、核受体活性、药物结合、蛋白激酶活性等。见图7C。共纳入533条信号通路，包括cAMP信号通路、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等。见图7D。

图7 各种相关富集分析

作为哺乳动物的常见模型动物,目前脊髓损伤基础研究领域常用的实验动物有大鼠和小鼠。大鼠因其在体型以及可操作性上优于小鼠，所以是脊髓损伤中最常用的实验动物。一般选择180～220 g雌性大鼠，Allens法在大鼠的撞击部位形成囊性空洞，并进一步引起局部炎症反应[18-20]。在造模时，实验动物出现摆尾反射、双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪，BBB运动评定量表评分≤2被确认脊髓损伤造模成功[21-22]。

由于中药方剂成分的复杂性，存在一些亟待解决的问题。值得注意的是，中药在成分靶点研究方面与西药比较存在一定的滞后性，并且二者之间无有效的交互作用，这是中药有效成分基础研究和相关机制研究目前存在的问题之一。随着网络药理学的发展，逐渐将公开的药物数据与遗传-疾病相关性、基因表达信息和PPI数据整合，从而进一步研究药物之间的关系以及药物与疾病之间的关系[23]。

本研究基于网络药理学分析了二仙汤加减中18味中药成分的潜在蛋白靶点，以及SCI疾病的基因潜在靶点，利用4个数据库检索的靶标构建药物疾病网络图，二仙汤加减的单一药物成分可能作用于多个靶点，多种成分可能作用于单个靶点。具有多个靶蛋白的活性成分可能比单靶成分具有更好的临床疗效和更少的不良反应。通过GO与KEGG相关富集分析，生物学途径主要有药物反应、凋亡过程负向调控、细胞增殖正向调控、血管生成正调控等，参与的细胞组分主要有胞外间隙、神经元投射等，分子功能主要包括药物结合、蛋白激酶活性、酶结合等。在cAMP等信号通路中Ryanodine受体可能参与调控。

Ryanodine受体(Ryanodine Receptors，RyRs)是肌肉、神经组织等多种可兴奋组织的一类细胞内钙通道，RyRs由3种主要亚型(RyR1、2和3)组成，通过不同的信号通路参与不同细胞内细胞器钙的释放[23]。既往研究认为，RyR2通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系2介导的氧化还原状态的调节从而线粒体和内质网功能障碍及炎症在SCI中发挥重要作用[24]。本研究进一步验证了cAMP信号通路在SCI治疗中的意义。

基于网络药理学与动物实验等方法探讨二仙汤加减方在SCI治疗中的作用机制，发现二仙汤加减方剂中的川芎、当归、丹参、香附、延胡索、淫羊藿、郁金等关键活性成分可能通过AKT1、MAPK3、NFKBIA、FOS、PIK3CG等关键基因介导cAMP、PI3K/AKT、MAPK、TNF等信号通路，起到治疗SCI的目的。但在动物实验中，二仙汤加减采用颗粒包装开水冲服的方法，是否丢失了熬药时药物成分之间的交互作用，无从得知，仍需要进一步研究。

猜你喜欢 汤加减靶标脊髓 纳米载体可缓解农药对靶标作物的负作用今日农业(2022年4期)2022-11-16人工3D脊髓能帮助瘫痪者重新行走?军事文摘(2022年8期)2022-11-03Modified Gexiazhuyu decoction (膈下逐瘀汤加减方) alleviates chronic salpingitis via p38 signaling pathwayJournal of Traditional Chinese Medicine(2022年2期)2022-07-28保元汤加减治疗冠心病的临床观察中国典型病例大全(2022年12期)2022-05-13靶标龙伯球一体化反射器电磁和气动特性融合设计火力与指挥控制(2022年3期)2022-04-27中医针灸疗法治疗脊髓损伤后膀胱功能障碍优势探中国典型病例大全(2022年9期)2022-04-19猕猴脊髓损伤康复训练装置的研制现代仪器与医疗(2022年1期)2022-04-19基于网络药理学及分子对接技术分析清眩降压汤治疗高血压的作用机制福建中医药(2022年2期)2022-03-24柴桂龙牡汤加减与黛力新治疗恶性肿瘤伴焦虑效果分析医学前沿(2021年18期)2021-04-14靶标评改，让习作评改有序更有效师道·教研(2019年7期)2019-08-13

推荐访问:药理学 脊髓 损伤