小剂量5-氟尿嘧啶对哮喘小鼠气道炎症的影响

王 童 邓霓姗 李 昀 钟洁莹 倪海阳 黄 毅 丁续红 聂汉祥

武汉大学人民医院呼吸与危重症医学科 湖北 武汉 430060

支气管哮喘是一种多种细胞参与的以高水平IgE 和Th2 反应为病理生理特征的慢性气道炎症性疾病。树突状细胞是主要的专职抗原提呈细胞，可以诱导初始CD4+T 细胞分化为Th2 细胞，参与哮喘Th2 反应的启动和维持［1］。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）在临床上主要被用作为抗肿瘤化疗药物，但目前认为小剂量5-FU（50 mg/kg）通过直接或间接影响机体的多种免疫细胞发挥免疫调节作用［2］。研究发现小剂量5-FU 通过选择性杀伤肿瘤相关髓源性抑制细胞从而增强肿瘤特异性CD8+T细胞的抗肿瘤免疫［3］，而炎性树突状细胞与髓源性抑制细胞可能来自于相同的前体细胞［4］，因此假设小剂量5-FU 可能在哮喘治疗中发挥免疫调节作用，从而影响哮喘气道炎症。本实验通过建立小鼠哮喘模型，观察小剂量5-FU 对哮喘小鼠气道炎症的影响，探讨其在哮喘治疗中的可能性。

1.1 实验动物与主要试剂6～8 周龄健康雌性野生型（Wild-type，WT）BALB/c 小鼠，无特定病原菌（Specific-Pathogen Free，SPF）环境饲养。鸡卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA，Grade Ⅴ）、氢氧化铝凝胶和5-FU 购于美国Sigma 公司；
血清OVA 特异性IgE、IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ ELISA 试剂盒购于美国eBioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠分组和哮喘模型的建立 15 只WTBALB/c 小鼠按随机数字表法分入正常对照组、哮喘对照组和5-FU 治疗组，每组5 只。哮喘对照组和5-FU 治疗组分别于第0 天、第14 天以OVA/Alum致敏液200 μL 腹腔注射进行致敏，第21、22、23 天连续3 d 经鼻腔滴入OVA 激发液50 μL 进行激发；
正常对照组相应时间以等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替。每次激发前，用1%戊巴比妥钠溶液腹腔注射（剂量为60～80 mg/kg 体重）使小鼠麻醉。其中5-FU 治疗组在第一次激发前24 h 给予单次5-FU（50 mg/kg）腹腔注射，正常和哮喘对照组则在相应时间使用等量PBS 替代。

1.2.2标本的收集处理与细胞学、组织学检查各组小鼠于末次激发24 h 后进行眼球取血收集标本，并予以肝素抗凝，3 000 r/min 离心10 min 分离出血清，-80 ℃保存，用于检测OVA 特异性IgE 水平。取血后暴露小鼠颈部气管，插入套管针，暴露胸腔，结扎右肺门，用含1 mmol/L EDTA 的冷PBS 0.5 mL 灌洗，每次在肺内停留30 s，回抽肺泡灌洗液，共3 次，灌洗时注意观察小鼠两侧胸廓起伏程度是否一致，有无漏液，回抽率在80%以上被认为灌洗成功。支气管肺泡灌洗液（BALF）在4 ℃下1 500 r/min 离心7 min，-80 ℃保存上清液，用于检测IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ的水平。使用含1%BSA 的PBS 重悬细胞沉淀，调整细胞数为1×109/L，取100 μL 细胞悬液离心涂片，瑞氏-姬姆萨染色检测细胞总数和细胞分类计数。取小鼠左肺组织，以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋后切片，采用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和糖原染色（periodic acid-schiff staining，PAS）观察肺组织炎症细胞和气道基底膜PAS 阳性细胞（杯状细胞）。

1.2.3ELISA 法检测细胞因子 采用ELISA 法检测血清OVA 特异性IgE 及BALF 中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的水平，具体步骤参考试剂说明书进行。

1.3 统计学分析应用SPSS 26.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2.1 各组小鼠HE 及PAS 染色的比较采用HE和PAS 染色评估小鼠气道炎症浸润和杯状细胞增生程度。HE 染色可见正常对照组小鼠肺组织支气管及血管周围无炎性细胞浸润，支气管黏膜上皮完整，肺间质无炎性细胞浸润，肺泡间隔完整。哮喘对照组小鼠肺组织或血管周围可见大量炎性细胞浸润，聚集成团明显，细胞层数超过5 层，支气管黏膜上皮脱落明显，肺间质也可见成团细胞浸润，肺泡间隔断裂，多个肺泡融合。5-FU 治疗组小鼠肺组织支气管或血管周围炎性细胞浸润明显减少，肺间质炎性细胞浸润减少，支气管黏膜少有脱落，肺泡间隔较为完整（图1）。

图1 各组小鼠肺组织HE 染色和PAS 染色

PAS 染色中正常对照组小鼠气道无PAS 阳性细胞，而哮喘对照组小鼠气道可见大量PAS 阳性细胞（图1）。5-FU 治疗组、哮喘对照组和正常对照组小鼠气道单位长度基底膜PAS 阳性细胞数量分别为（66±6）、（97±5）和（0±0）个/mm，3 组间差异有统计学意义（P＜0.01）（见图2）。

图2 各组小鼠气道单位长度基底膜（mm）PAS 阳性细胞数量（**P＜0.01）

2.2 各组小鼠BALF 中细胞总数和分类计数染色的比较正常对照组小鼠BALF 中细胞主要为巨噬细胞，淋巴细胞较少，未检测到有中性粒细胞和嗜酸粒细胞。哮喘对照组小鼠BALF 中细胞总数、巨噬细胞数、嗜酸粒细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞计数均显著高于正常对照组（P＜0.01）；
5-FU 治疗组小鼠BALF 中细胞总数、嗜酸粒细胞数和巨噬细胞计数明显低于哮喘对照组（P＜0.01）（图3）。

图3 各组小鼠BALF 中细胞总数和分类计数

2.3 各组小鼠血清OVA 特异性IgE 及BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ 水平的比较正常对照组小鼠血清OVA 特异性IgE 及BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 均处于较低水平。哮喘对照组和5-FU 治疗组小鼠血清OVA 特异性IgE 的浓度值分别为（95.2±5.0）ng/mL 和（71.4±3.6）ng/mL，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）（图4）。5-FU 治疗组小鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 水平均明显低于哮喘对照组（P＜0.01）（图5）。5-FU 治疗组和哮喘对照组小鼠的BALF 中IFN-γ水平比较无统计学差异（P＞0.05），但均低于正常对照组（P＜0.01）（图5）。

图4 各组小鼠血清OVA 特异性IgE 水平

图5 各组小鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ 水平

支气管哮喘是一种由多种细胞，如肥大细胞、嗜酸粒细胞、T 淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等参与的慢性气道炎症性疾病。目前，哮喘治疗的基本方案是吸入糖皮质激素联用或不联用β2 受体激动剂。这种方案可以使大部分哮喘患者获得良好控制。然而，即使是吸入高剂量糖皮质激素和长效β2受体激动剂或联用茶碱/白三烯调节剂，甚至是系统性使用糖皮质激素，仍然存在3.7%的重症哮喘和17%的难治性哮喘患者［5］。对于这部分哮喘患者，治疗选择有限。因此，寻找哮喘治疗的新方法尤显必要。

5-FU 是一种临床上广泛应用的嘧啶类抗肿瘤化疗药，主要用于消化道肿瘤、乳腺癌和宫颈癌等恶性肿瘤的治疗。5-FU 的抗肿瘤效应主要是通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的活性，从而导致细胞内DNA 合成原料缺乏，干扰肿瘤细胞增殖［6］。近年来发现小剂量5-FU 具有免疫调节作用。研究发现小剂量5-FU 可以减轻急性胰腺炎相关免疫细胞因子的异常反应，调节炎症失调，缓解急性胰腺炎的病理生理紊乱，结果提示小剂量5-FU 通过调节免疫反应发挥抗炎效应［7］。本研究发现小剂量5-FU 可以抑制哮喘小鼠血清OVA 特异性IgE 水平，降低BALF 中细胞总数、嗜酸粒细胞数和巨噬细胞数，减轻肺组织支气管炎症细胞和杯状细胞浸润，提示小剂量5-FU 可以抑制哮喘小鼠气道炎症反应。进一步研究发现小剂量5-FU 治 疗 可 以 使 哮 喘 小 鼠BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 的水平明显降低。目前认为CD4+Th2 细胞是哮喘发病的重要环节，它通过产生Th2 细胞因子，如IL-4、IL-5 和IL-13 等参与形成哮喘的气道炎症和气道高反应性［8］。IL-4 可以刺激B 细胞产生IgE，促进Th0 细胞向Th2 细胞方向分化，抑制Th0 细胞向Th1 细胞分化；
IL-5 促进嗜酸粒细胞分化，延长气道中嗜酸粒细胞的存活［9］，IL-13 则诱导嗜酸粒细胞增多、黏液产生、气道重塑和气道高反应性［10］。因此，我们推测小剂量5-FU 可能通过抑制Th2 细胞因子水平进一步控制哮喘气道炎症。目前认为树突状细胞作为主要的抗原提呈细胞可以诱导初始CD4+T 细胞向Th2 细胞分化，启动和维持哮喘Th2 免疫反应。研究显示小鼠肺树突状细胞可以分为髓样树突状细胞（myeloid dendritic cells，mDCs）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）。mDCs 又称为经典树突状细胞（conventional dendritic cells，cDCs），其可以分为1 型经典 树 突 状 细 胞（conventional DCs 1，cDCs1），即CD103+经典树突状细胞（CD103+cDCs）和2 型经典 树 突 状 细 胞（conventional DCs 2，cDCs2），即CD11b+经典树突状细胞（CD11b+cDCs）［11］。在感染或吸入过敏原时，肺的屏障上皮细胞会产生促炎趋化因子如CCL2 和CCL7，可以促进骨髓释放CCR2hi单核细胞，当这些单核细胞作为炎症反应的一部分到达气道黏膜时，进一步分化为单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，moDCs），又 称 为 炎 性 树 突 状 细 胞［12］。目 前 认 为CD11b+cDCs 和moDCs 均可有效诱导Th2 细胞反应，导致哮喘气道炎症［13］，CD103+经典树突状细胞在哮喘Th2 反应中的作用有限，甚至主要是诱导免疫耐受，而浆细胞样树突状细胞主要与诱导气道免疫耐受有关［14］。Poncini 等［15］研究发现在急性皮肤克氏锥虫感染小鼠模型中腹腔注射小剂量5-FU 可以选择性诱导小鼠脾脏炎性树突状细胞数量明显减少，而对正常小鼠脾脏B 细胞、T 细胞、骨髓细胞、单核细胞和粒细胞无影响。因此，我们推测小剂量5-FU 可能通过作用于肺炎性树突状细胞进而抑制哮喘小鼠Th2 反应，进一步控制哮喘小鼠气道炎症。临床上，5-FU 用作为化疗药物治疗肿瘤时的主要副作用有食欲不振，恶心呕吐；
骨髓抑制，表现为白细胞减少、血小板减少和贫血；
肝功能损害等［16］。然而，5-FU 发挥免疫调节作用所需的剂量为小剂量，定义为对小鼠没有毒性作用且发挥最大效应，这个最佳剂量为50 mg/kg［17］。目前临床使用中发现连续低剂量5-FU 相比高剂量的5-FU，在治疗效果没有显著差异的情况下其血液学毒性明显降低，白细胞减少症发生率显著下降［18］，但在哮喘治疗中的副作用需进一步研究。

综上所述，小剂量5-FU 可以减轻哮喘小鼠的气道炎症，可能是通过抑制Th2 反应发挥作用，这可能为哮喘的治疗提供新的思路。

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