姜黄素类似物(H8)改善非酒精性脂肪性肝病的炎症反应及作用机制

陈 盈，高雪玲，吴英俊，袁晓环，李鲁新

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

NAFLD是以脂质积累为特征的肝脏疾病，高发于高脂血症、糖尿病患者。患者通常无明显的饮酒史但有摄入高脂的饮食习惯。研究表明，随着疾病进程，NAFLD可发展为肝硬化或肝癌，且能够增加心脑血管疾病的发生率[1-2]。目前NAFLD的发病率逐年上升，而尚缺乏有效的治疗药物[3-4]。

姜黄素是传统药物姜黄的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、控制肥胖和糖尿病等药理活性[5]，但因生物活性低，限制了其药用价值。我们通过合成姜黄素类似物(2E,5E)-2,5-双[2-氟-6-(三氟甲基)苄叉亚甲基]环戊酮(化合物号：H8)增加了生物利用度[6]，并证实H8可缓解2型糖尿病的胰岛素抵抗，但对NAFLD的影响尚不清楚。本研究旨在探讨H8改善NAFLD的炎症反应及作用机制，为治疗NAFLD提供新的研究基础。

1.1 试剂H8由牡丹江医学院设计合成。H8和姜黄素(上海Sigma公司)溶解于1%羧甲基纤维素钠(Sodium Carboxymethylcellulose，CMC-Na)(上海阿拉丁试剂有限公司)。SPF级大鼠维持饲料(辽宁长生生物技术股份有限公司)；
高脂高糖饲料(北京小黍有泰生物科技有限公司)，每60 kg含大鼠维持饲料44.22 kg、猪油9 kg、蛋黄粉6 kg、胆固醇0.72 kg、胆酸钠0.03 kg、丙硫氧嘧啶0.03 kg。链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)(北京索莱宝公司)；
小鼠胚胎成纤维细胞(3T3-L1)(CL-0103，丰晖生物科技有限公司)；
人肝癌细胞(HepG2)(武汉普诺赛生物科技有限公司)；
Compound C(上海MCE公司)；
异丁基-甲基-黄嘌呤(IBMX)(上海Sigma公司)；
地塞米松(DEX)(上海MCE公司)；
胰岛素注射液(安徽万邦医药科技有限公司)；
Rabbit Anti-Goat IgG(美国Abcam公司)；
Mouse Anti-Goat IgG(美国Abcam公司)；
IL-6 antibody(美国Abcam公司)；
TNF-α antibody(Bioss公司)；
NF-κB p-P65 antibody(affinity公司)；
SIRT1 antibody(affinity公司)；
β-Actin antibody(cell signaling公司)；
总RNA提取试剂盒(OMEGA公司)；
FastStart Universal SYBR Green Master(Roche公司)。

1.2 仪器血糖测试仪(美国Roche公司)；
全自动生化分析仪(AU5800，美国Beckman Coulter公司)；
包埋机(EG1160，德国Leica公司)；
旋转式切片机(M18170E，德国Leica公司)；
冷冻切片机(德国Leica公司)；
生物显微镜(IX70，德国Leica公司)；
超微量蛋白核酸测定仪(NanoDrop 2000，美国Thermo公司)；
实时荧光定量Real-Time PCR(StepOne型，美国ABI公司)；
电泳仪(1658001型，美国BIO-RAD公司)；
自动化学发光凝胶成像仪(美国General Electric公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物及分组 32只8周龄雄性SD大鼠[辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001]饲养于牡丹江医学院SPF级动物实验室，环境温度(22±2)℃，湿度(60±5)%，12 h循环交替光照，实验动物可自由饮水进食。适应性喂养一周后，采用随机数字表法分为四组，每组8只，分别为Control组、Model组、Curcumin组、H8组。其中Control组大鼠采用SFP级大鼠维持饲料喂养；
其余3组大鼠以高脂高糖饲料喂养，8周后，隔日腹腔注射柠檬酸缓冲液溶解的STZ(25 mg/kg)；
Control组隔日腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，各组共计3次。72 h后测量大鼠空腹血糖，连续3 d血糖>11.1 mmol/L，且低密度脂蛋白水平显著增高，提示大鼠模型建立成功。Curcumin组大鼠以1% CMC-Na溶解的姜黄素(6 mg/kg)灌胃，H8组大鼠以1% CMC-Na溶解的H8(6 mg/kg)灌胃，1次/d，连续4周；
Control组和Model组每日以等量1% CMC-Na溶液连续灌胃4周。灌胃第4周末，采用腹腔注射10%水合氯醛麻各组大鼠，眼眦静脉取血，分离小鼠肝脏等器官组织，称量记录各组小鼠肝脏重体重，部分肝脏组织浸泡于10%福尔马林固定48 h，剩余肝脏保存于-80 ℃备用。以上实验操作均通过牡丹江医学院动物保护与使用委员会批准。

1.3.2 细胞培养 采用含有10% FBS的高糖DMEM培养基复苏HepG2和3T3-L1细胞于T25细胞培养瓶，培养箱环境条件为37 ℃、5% CO2，待细胞状态稳定。将3T3-L1细胞以1×105个细胞/孔的密度接种于六孔板，分为Con组，Dia组，H8组。待各组细胞长满至80%～90%后，继续培养2 d，细胞进入接触抑制状态后换诱导培养基1(培养基1成分为高糖DMEM培养基、10% FBS、10 μg/mL胰岛素注射液、0.5 mM IBMX、1 μM DEX)培养2 d，换诱导培养基2(培养基2成分为高糖DMEM培养基、10% FBS、10 μg/mL胰岛素注射液)继续培养2 d，换含有10% FBS的高糖DMEM培养一周，显微镜下观察3T3-L1细胞90%表现为成熟脂肪细胞表型，即诱导成功。Dia组，H8组的分化后3T3-L1细胞采用含有1 mM游离脂肪酸(油酸∶棕榈酸=2∶1)的DMEM培养基孵育24 h，采用含有5 μM H8的DMEM培养基孵育分化后的3T3-L1细胞24 h。取长满至80%～90%的HepG2细胞，以1×106个细胞/孔的密度接种于六孔板，实验分为Con组，Con+Compound C组，Dia组，Dia+Compound C+H8组。Con+Compound C组和Dia+Compound C+H8组的HepG2细胞采用含有10 μM AMPK抑制剂Compound C的DMEM培养基孵育2 h，Dia组和Dia+Compound C+H8组的HepG2细胞采用含有1 mM游离脂肪酸的DMEM培养基孵育24 h，采用含有5 μM H8的DMEM培养基孵育Dia+Compound C+H8组的HepG2细胞24 h。

1.3.3 生化指标的检测 将各组大鼠静脉血5000×g离心10 min，取血清于全自动生化分析仪，检测血清转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.3.4 肝脏组织病理学观察 将固定48 h后的大鼠肝脏梯度乙醇脱水，石蜡包埋。采用旋转切片机切成4 μm的切片。采用苏木精和伊红(HE)染色，测定肝脏组织病理形态。取-80℃保存的大鼠肝脏冷冻包埋，在冷冻切片机中切成10 μm切片，进行油红O染色测定肝脏组织中脂滴的存在。用0.3% Triton X通透组织3 min，然后用60%异丙醇冲洗，用油红O工作液于65℃，避光条件下染色30～45 min。显微镜下观察大鼠肝脏组织的形态和脂滴堆积。

1.3.5 Real-Time PCR法检测样本中mRNA表达水平 使用总RNA提取试剂盒提取肝组织(50 mg)或细胞(1×106个细胞/孔)中总RNA。超微量蛋白核酸测定仪测量RNA浓度，取1 μg样本，使用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用FastStart Universal SYBR Green Master于实时荧光定量Real-Time PCR进行扩增反应。引物见表1，扩增条件如下：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s；
55 ℃退火30 s；
扩增40个循环，每组样本做2个平行复孔，检测各组基因和内参的Ct值，采用2-ΔCT值法计算目的基因的相对表达量。

表1 内参及炎症相关基因mRNA引物序列

1.3.6 Western Blot法检测样本中蛋白表达水平 用RIPA裂解液和蛋白磷酸酶抑制剂裂解肝组织(50 mg)或细胞(1×106个细胞/孔)，提取总蛋白。超微量蛋白核酸测定仪测量蛋白质浓度，取50 μg蛋白样品，变性后上样于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中80 V电压电泳1.5 h分离不同分子量的蛋白质，恒流200 mA转膜1 h，将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1 h，在4 ℃条件下用适当一抗孵育12 h，室温条件下用二抗孵育1 h，ECL显色液显色后，采用自动化学发光凝胶成像仪拍摄显色条带，采用Image J软件分析蛋白表达量。

1.4 统计学分析本实验数据使用GraphPad Prism 8.2.1版本软件(GraphPad软件公司)进行评估，采用单因素方差分析(ANOVA)对各组组间差异进行比较。“N”表示独立实验次数(N=3)或大鼠数量(N=8)。计量资料以“均数±标准差”表示，P值<0.05具有统计学意义。

2.1 H8改善NAFLD大鼠肝功能与Control组相比，Model组大鼠的肝重体重比显著上升(P<0.01)；
Curcumin组和H8组的肝重体重比相较于Model组显著降低(P<0.05或P<0.01)。与Control组相比，Model组大鼠的血清AST/ALT，TC，TG，LDL水平显著上升，而血清HDL水平显著下调(P<0.01)；
相较于Model组，H8组的大鼠血清AST/ALT，TC，TG，LDL水平明显降低，血清HDL水平显著上升(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明，高脂饮食可诱导大鼠肝功能损伤，而H8可有效缓解高脂诱导的肝损伤，降低肝重体重比(表2)。

表2 H8对各组肝重体重比与血清中生化指标的影响

2.2 H8缓解NAFLD大鼠肝脏的脂肪堆积如图1所示，HE染色结果显示，Control组的大鼠肝细胞小叶排列紧密，具有典型的正常肝细胞特征。相对于Control组，Model组围绕中央静脉血管呈现放射状的脂肪空泡，肝细胞小叶排列不规则，肝细胞形态损坏。Curcumin组和H8组相对于Model组均能缓解肝脏组织形态的损伤。油红染色结果显示，Control组肝脏仅有少量油滴，Model组相比Control组存在大量油滴聚集，H8组相较于Model组油滴减少。表明高脂饮食可导致脂质在肝脏聚集，并引起肝脏组织形态的变化，而H8的治疗可有效恢复肝脏组织形态，降低脂质堆积。

图1 H8改善NAFLD肝脏病理形态学的变化(×40)；
比例尺：50 μm

2.3 H8降低NAFLD大鼠肝脏组织中炎症因子的表达如图2A、2B所示，与Control组相比，Model组肝脏中IL-6和TNF-α的mRNA水平显著升高(P<0.05或P<0.01)；
与Model组相比，Curcumin组和H8组的IL-6和TNF-α mRNA水平显著降低(P<0.01或P<0.001)。如图2C、2D、2E中WB结果显示，与Control组相比，Model组中IL-6、TNF-α和p-P65的蛋白表达水平也显著上升(P<0.05或P<0.01)；
与Model组相比，Curcumin与H8组中IL-6、TNF-α和p-P65的蛋白表达水平显著下降(P<0.05或P<0.001)。

图2 H8缓解NAFLD大鼠肝脏组织中炎症因子的表达

2.4 H8在细胞水平抑制炎症因子的表达如图3所示，在HepG2细胞中，抑制AMPK的活性或游离脂肪酸的诱导可显著降低SIRT1蛋白水平的表达(P<0.01)；
而H8组可恢复SIRT1蛋白水平(P<0.05或P<0.01)。抑制AMPK的活性或游离脂肪酸的诱导可使TNF-α的蛋白水平显著上升(P<0.01或P<0.001)；
而H8组可降低p-P65、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平(P<0.05，P<0.01或P<0.001)。

图3 H8在细胞水平发挥抗炎作用

2.5 H8恢复AMPK和SIRT1蛋白表达抑制炎症因子的表达如图4所示，在分化后的3T3-L1细胞中，与Con组相比，Dia组的p-AMPK和SIRT1蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.001)；
而H8组可恢复p-AMPK和SIRT1蛋白水平(P<0.05)。同时Dia组的p-P65蛋白水平显著上升(P<0.05)；
与Dia相比，H8组可降低p-P65的蛋白表达(P<0.01)。

图4 H8对脂肪细胞中AMPK与SIRT1的影响

中草药姜黄中的主要成分姜黄素是11β-固醇脱氢酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD1)的天然抑制剂，具有诸多生理功能[7]。本课题组前期研究证实H8可特异性靶向抑制11β-HSD1，通过降低糖皮质激素水平减轻STZ诱导的糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，改善肝组织糖代谢紊乱，发挥降低内脏脂肪、降低血糖和抗胰岛素抵抗的功效[8]。但H8对于NAFLD的作用尚未进行深入探讨。本研究发现，H8通过恢复AMPK活性，对NAFLD模型大鼠的肝脏发挥抗炎作用。

目前，最被广泛认可的NAFLD发病机制为“二次打击”模型[9]。第一次打击，是指肝脏中脂质超载或胰岛素抵抗等因素，导致肝细胞损害。在这种情况下，机体会应激发生各种病理生理反应，如NF-κB的激活，其中就伴随着p-P65，IL-6等炎症因子的升高，它们可介导慢性肝脏炎症，被认为是第二次打击。这两次打击导致肝脏功能损伤，肝脏代谢脂质能力减弱，进一步加重肝细胞的脂质载量和慢性炎症，形成恶性循环加重肝脏负担。因此，保护肝脏免受脂质积聚或慢性炎症的影响是预防NAFLD进展的主要策略。

本研究通过检测血清生化指标和肝脏病理形态，证实了高脂饮食可升高NAFLD模型大鼠的血清AST/ALT水平，提示机体肝功能损伤；
HE和油红O染色结果表明，肝脏组织形态受损且有大量的脂质堆积；
qRT-PCR和WB证实炎症因子IL-6、TNF-α和p-P65的基因和蛋白水平升高。这些特征与“二次打击”模型一致。而姜黄素和H8均可有效缓解以上症状，油红染色结果显示，H8比姜黄素更能降低脂质堆积。

此外，Hu[10-11]等人的实验结果证实，姜黄素具有抗炎作用，而H8的抗炎作用还需要进一步的研究。由于NAFLD的进展与脂质堆积正相关，我们通过经典“鸡尾酒法”[12]诱导3T3-L1细胞为成熟的脂肪细胞，并观察H8对其影响。结果证实，在游离脂肪酸诱导的情况下，脂肪细胞的p-P65表达水平增加，而AMPK与SIRT1的表达水平降低，H8的处理可以缓解上述现象。AMPK是一种由催化α亚基和两个调节亚基β和γ组成的异三聚体复合物。在哺乳动物细胞中，AMPK信号通路是脂质稳态最重要的调节因子之一，其激活可恢复脂肪酸β氧化，降低脂肪的从头合成。

Kim[13]等人的研究表明，AMPK的激活可平衡肝脏脂代谢，同时也能激活SIRT1的表达。SIRT1是保守的NAD+依赖的组蛋白，通过脱乙酰化NF-κB复合物的P65亚基，降低NF-κB信号通路和TNF-α、IL-6等促炎因子的激活，对哺乳动物细胞的脂质代谢、氧化应激和炎症反应发挥重要调控作用。为了证实H8通过恢复AMPK的活性激活SIRT1发挥抗炎作用，我们使用AMPK抑制剂Compound C[14]进行后续的实验。结果证实，AMPK的抑制会显著降低SIRT1的活性，从而导致p-P65、TNF-α、IL-6的表达增加。而H8的能够显著恢复SIRT1的水平，降低炎症因子的表达。这些结果证实，H8通过恢复AMPK的活性发挥抗炎作用。

综上所述，姜黄素类似物H8可降低NAFLD模型大鼠血清中AST/ALT水平，降低肝脏的脂质堆积和p-P65、TNF-α、IL-6等炎症因子的产生。H8通过恢复AMPK的活性发挥抗炎作用，为治疗NAFLD提供了新的研究基础。

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