锝亚甲基二膦酸盐注射液细菌内毒素定量检测

冀 红，杨 旭

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

注射用亚锡亚甲基二膦酸盐无菌粉末与99Mo-99mTc发生器配套使用，制备锝[99mTc]亚甲基二膦酸盐注射液(99mTc-MDP)。99mTc-MDP是目前公认的较理想骨显像剂，通过化学吸附与骨骼无机成分中的羟基磷灰石结晶表面结合，在骨骼内沉积的多少受局部血流量和骨骼无机盐代谢及成骨活血程度等因素的影响[1-3]。因此，当某些骨骼部位发生病理性改变时，如炎症、肿瘤、骨折等，均可导致血供、代谢的变化，于相应部位呈现影像异常，从而对各种骨骼疾患提供诊断和定位依据。

细菌内毒素检查法(BET)是利用鲎试剂检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判定供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，已十分成熟。2020版《中国药典》二部对99mTc-MDP的质量标准做出了明确规定，其中细菌内毒素限值<15 EU/mL[4-6]。细菌内毒素检查方法包括凝胶法和光度法。凝胶法通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应进行限度检测或半定量检测内毒素，通过凝胶的坚实程度判断检测结果，具有操作简单、容易掌握的优点，但实验结果为定性、反应过程不可视、缺乏数据完整性。光度法是定量分析方法，光度测定法分为浊度法与显色法。浊度法分为动态浊度法与终点浊度法；
显色法分为动态显色法与终点显色法。终点显色法依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出显色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光度达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。其原理是依据鲎试剂与内毒素发生反应，使用动态光度仪，利用反应时间与标准内毒素浓度关系的标准曲线，计算供试品的内毒素含量。其优点为检验范围宽、灵敏度高、检验结果直观准确，定量的检测结果可用于产品的内毒素含量的趋势分析，衡量产品的质量水平。凝胶法实验因操作简单易于推广，在我国使用比较普遍[7-8]。

目前，随着对药品质量的要求越来越高，对检测技术的要求也在不断提高[9]。放射性药品检测有其特殊性，既要防止污染又要及时准确完成检测工作。准确分析内毒素含量，不仅可以评估产品在生产过程中污染的相对风险，还可以分析产品的质量趋势，起到风险预警的作用[10-12]。同时，细菌内毒素检查所需的鲎试剂为海洋生物鲎的血液变形细胞溶胞的冷冻干燥品。凝胶法不同灵敏度的鲎试剂装样量一般为0.1 mg，加样量是0.1 mL；
光度动态法采用微量技术，加样量是25 μL。因此，从保护鲎资源理念出发，在考量市场鲎试剂供应和使用量的同时，有必要建立准确、可靠的内毒素含量分析方法。本文对样品溶解条件、干扰实验、标准曲线可靠性实验等进行研究，在相同条件下采用动态显色法和凝胶法进行检测，对比两种检测方法的实验结果，建立99mTc-MDP光度动态显色法测定内毒素含量的分析方法。

光度测定仪：FC/ET型酶标分析仪，芬兰Thermo(赛默飞)；
试管恒温仪：TAL-400，湛江安度斯生物有限公司。

动态显色法(KCA)鲎试剂：规格0.01～10 EU/mL，0.35 mL/支，批号2004070；
内毒素标准品：0.02～2.0 EU/mL，批号1907180；
细菌内毒素检查(BET)用水：5 mL/支，内毒素<0.003 EU/mL,批号2103120；
凝胶法鲎试剂：规格0.1 mL/支，灵敏度0.5 EU/mL，批号2102192；
细菌内毒素检查微孔反应板：批号191018-594，细菌内毒素含量<0.005 EU/mL，无热原空安瓿，移液器，无热原吸头。以上均为湛江安度斯生物科技有限公司产品。

动态显色法光度测定在光度测定仪器中进行，温度为(37± 1) ℃，反应时间60 min以保证显色实验的有效性，预先进行标准曲线的可靠性实验以及供试品的干扰实验，确定99mTc-MDP内毒素光度法的检测方法；
采用凝胶法和光度法检验同批号的99mTc-MDP，比较二者的实验结果；
取不同活度的供试品进行光度法检测，研究99mTc-MDP放射性对光度动态显色法的影响。

2.1 99mTc-MDP制备

在无菌操作条件下，依高锝[99mTc]酸钠注射液的放射性浓度，取4 mL注入注射用亚细亚甲基二膦酸盐瓶中，充分振摇，使冻干物溶解，静止5 min，即得。

2.2 99mTc-MDP最大有效稀释倍数

供试品的最大有效稀释倍数MVD根据公式(1)进行计算：

MVD=CL/λ

(1)

式中：λ为标准曲线最低点浓度，0.02 EU/mL；
C为供试品溶液浓度，按1 mL/mL；
L为供试品的细菌内毒素限值，《中国药典》规定99mTc-MDP细菌内毒素限值15 EU/mL。根据公式(1)计算出MVD=750倍。

2.3 标准曲线可靠性实验(动态显色法)

当使用新批号的鲎试剂或实验条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性实验。建立标准曲线包括梯度不大于10倍的至少三个标准内毒素浓度，每一浓度内毒素溶液(C溶液)至少平行3孔，阴性对照平行2孔。

2.3.1标准品制备 光度测定法专用工作标准品以0.46、0.73、0.75 mL细菌内毒素检查用水溶解，旋涡混合60 s，制备2.0、0.2、0.02 EU/mL细菌内毒素标准溶液。按使用批次标准品要求进行复溶，附分析证书CoA的指示加水复溶安瓿内白色冻干粉。

2.3.2标准曲线可靠性实验 将鲎试剂用0.35 mL BET水溶解，轻轻摇匀，使内容物充分溶解，避免产生气泡。然后向微孔板里加入25 μL鲎试剂，阴性对照溶液(D溶液)再加入25 μL BET水，其他微孔加入25 μL内毒素溶液，具体按照表1标准曲线项目布板方式加样。最后，设置实验参数和反应项目。把反应板放置仪器中，反应时长60 min。

表1 标准曲线项目布板

2.4 干扰实验

验证在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有没有干扰，从而确定检验供试品的制备方法(检测浓度或稀释倍数)。

根据《中国药典》的细菌内毒素检查法，实验应设置4个反应项目，每种溶液2个平行。供试品溶液(A溶液)：用细菌内毒素检查用水将99mTc-MDP注射液稀释为30倍、60倍、90倍的溶液。供试品溶液(B溶液)：用A溶液0.73 mL复溶标示为0.2 EU/mL的工作标准品，得到99mTc-MDP注射液稀释30倍、60倍、90倍的供试品溶液加入已知内毒素浓度0.2 EU/mL。内毒素标准溶液(C溶液)：方法同2.3.1节，制备标准曲线的内毒素标椎溶液，即2.0、0.2、0.02 EU/mL标准品溶液。阴性对照(D溶液)：细菌内毒素检查用水。按项目布板在微孔板中先加25 μL以上溶液(表2)，顺序为阴性、标准曲线、供试品溶液、供试品阳性溶液；
然后加入25 μL鲎试剂。加样完毕后，反应板放置仪器中，反应时长60 min。供试品当日检验后，将其放置24 h，即经过4个半衰期后，再检测内毒素含量，对比两次的检验结果。

表2 干扰实验项目布板

2.5 动态显色法检测99mTc-MDP

根据干扰实验结果，选择无干扰的供试品浓度进行BET检查。各反应浓度的制备反应项目设置与干扰实验相同。选择3批99mTc-MDP不同活度的供试品，进行动态显色法定量检测。采用凝胶法检验以上3批产品，比较二种检验方法的结果。

3.1 标准曲线可靠性实验

标准曲线和回归方程示于图1。图1数据结果显示，阴性对照的吸光度反应时间(TNC)大于标准曲线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)-1.000的绝对值大于0.980。即标准曲线范围：2.0～0.02 EU/mL，TNC>Tλ，|r|≥0.980，CV<10%(参考值，CV=标椎偏差SD/平均值Mean*100%)，标准曲线符合规定。

图1 标准曲线和回归方程

3.2 干扰实验

4批99mTc-MDP(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)用光度动态显色法检测内毒素含量的结果与放置24 h后内毒素含量的检测结果列于表3。表3中四组实验符合以下三个条件：(1) 系列溶液C的结果满足“标椎曲线的可靠性实验”中的要求；
(2) 回收率R满足：50%≤R≤200%；
R=(CS-CT)/λm*100% ，CT供试品内毒素含量，CS含标准内毒素的供试品内毒素含量，λm为标准曲线的中点浓度0.2 EU/mL；
(3) 阴性对照的反应时间λ大于标准曲线最低点的反应时间。

表3 不同批次99mTc-MDP在不同检测浓度的回收率

3.3 确定有效稀释倍数

99mTc-MDP供试品(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)稀释30倍(S30)、60倍(S60)、90倍(S90)回收率趋势比较示于图2。均在最大有效稀释倍数750内，对内毒素检查光度测定动态显色法，无干扰。确定99mTc-MDP细菌内毒素检查可以采用光度动态显色法。

图2 不同批次不同稀释倍数供试品回收率的比较

依据干扰实验的回收率，四组S30回收率分别是103.30%、96.85%、108.53%、92.57%，回收率R满足：50%≤R≤200%，对实验没有抑制和增强，即无干扰；
符合《中国药典》规定：取本品适量，用细菌内毒素检查用水至少稀释30倍后，依法检查。供试品30倍的稀释，步骤少，缩短实验操作时间，同时不影响供试品中的内毒素生物活性。所以，通过干扰实验，选定光度动态显色法(微量技术)检测99mTc-MDP的内毒素含量，并且选择供试品原液稀释30倍作为供试品溶液的日常检测。

3.4 光度动态显色法

四批次99mTc-MDP(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)光度动态法检测结果，稀释30 倍内毒素含量趋势示于图3。供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于《中国药典》规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。供试品99mTc-MDP (20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)内毒素检测数据均<0.600 EU/mL，产品质量稳定。

图3 不同批次99mTc-MDP稀释30倍后内毒素的含量

3.5 99mTc-MDP不同活度的细菌内毒素定量检查

选取3批99mTc-MDP供试品，批号为20211206-1-2、20211207-1-1、20211207-1-2初始活度分别为6.48、4.79、3.40 mCi，放置24、48、72 h。3批99mTc-MDP稀释30倍后的供试品溶液用光度动态显色法检测内毒素含量，检测结果列于表4。

表4 3批次不同活度99mTc-MDP在不同衰变时间的检测结果

3批99mTc-MDP不同活度的供试品，在0、24、48、72 h检验数据显示回收率均在80%～140%之间，符合《中国药典》规定50%≤R≤200%；
供试品内毒素含量均<0.600 EU/mL，符合《中国药典》规定的每1 mL含内毒素含量<15 EU。实验结果可以看出，不同活度的99mTc-MDP采用光度动态显色法测定(定量检测)的细菌内毒素含量没有差异。放射性药物99mTc-MDP对光度动态显色法测定(定量检测)的细菌内毒素含量无影响。

3批99mTc-MDP按《中国药典》中的凝胶法进行细菌内毒素检查，检查结果每1 mL含内毒素的量<15 EU，与光度动态显色法一致。

本实验研究99mTc-MDP细菌内毒素的定量检测，对于其他放射性示踪剂如锝[99mTc]甲氧异腈注射液(99mTc-MIBI)、锝[99mTc]焦磷酸盐注射液(99mTc-PYP)、锝[99mTc]双半胱氨酸注射液(99mTc-EC)、锝[99mTc]双半乙酯注射液(99mTc-ECD)、锝[99mTc]喷替酸盐注射液(99mTc-DTPA)、锝[99mTc]聚合白蛋白注射液(99mTc-MAA)、锝[99mTc]植酸盐注射液(99mTc-Phy)、锝[99mTc]依替菲宁注射液(99mTc-EHIDA)可以借鉴此方法，进行方法验证。每一个品种药典有记载其标准及限值，在2020版《中国药典》中记载九种锝标记药物，99mTc-MDP、99mTc-MIBI、99mTc-PYP、99mTc-EC、99mTc-DTPA、99mTc-MAA、99mTc-Phy、99mTc-EHIDA、99mTc-ECD，对细菌内毒素检查要求一致(方法和限值)。不同品种溶液成分不同，其中的某些成分会对细菌内毒素检查法产生干扰作用，所以需要排除干扰，通过干扰实验，确定有效的稀释倍数，进行光度法检验。实际检验中，光度法可以一次检验多个供试品(一个微孔板可以最多检22个供试品)。为了提高药品质量和用药安全，依《中国药典》的国家药品标准，强化药品的质量控制，紧跟国际先进检测技术的发展趋势。99mTc-MDP定量检测方法对内毒素含量内控指标具有指导意义。通过建立99mTc-MDP的定量检测方法，对其他放射性示踪剂的细菌内毒素光度法的检测技术有指导及支持作用。建立准确、可靠的99mTc-MDP内毒素定量分析方法十分必要。

综上所述，本工作建立的光度动态显色法鲎实验灵敏度高，排除干扰的能力强；
实验操作方便快捷，检测结果准确可靠。定量的检测结果可用于产品内毒素含量的趋势分析，有利于产品质量趋势追踪及在超过指标并导致产品不合格前识别和纠正偏差。当产品数据出现不稳定，虽在检验合格范围内，但也要追溯产品生产工艺过程。光度动态显色法检测的范围比凝胶法宽泛，使得有干扰的样品可以有更多的稀释空间，当部分凝胶法无法排除干扰的样品时，可以选择光度动态法。操作也相对简单，尤其对于研究性的样品，更具有优势。

按照《中国药典》2020年版规定,99mTc-MDP内毒素含量应<15 EU/mL。使用FC/ET型酶标分析仪，选择光度动态显色微量技术法定量检测99mTc-MDP的内毒素含量，快捷、简便、准确，符合实验数据完整性的要求。放射性药物99mTc-MDP对光度动态显色法测定的细菌内毒素含量无影响。新建立的99mTc-MDP光度动态显色法可以定量检测内毒素含量，是一种准确、可靠的细菌内毒素检查方法。

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