两种质量浓度磷肥胁迫后柴胡各部位含皂苷量变化

苗 方,孙佳琳,李伟男

(1.菏泽医学专科学校, 山东 菏泽,274000；
2.黑龙江民族职业学院，哈尔滨 150020；
3.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

柴胡属药用植物，由于其显著且稳定的临床疗效，在中国和其他亚洲国家已经使用了数千年.柴胡根、叶提取物在中药中有着悠久的应用历史和重要的经济价值.柴胡中含有多种化学成分，包括皂苷、挥发油、黄酮、多糖等成分.柴胡皂苷a和d的含量也被收载进《中国药典》作为评价柴胡质量的重要指标.

由于柴胡属植物的地上部分占整个植物的一半以上，柴胡植株地上部位(花、茎、叶)的药效成分含量低于地下部位(根)[1].目前多以柴胡根部作为药用部位，但柴胡的质量控制以及柴胡用药部位仍存在争议[2].

植物代谢研究已广泛应用于中药活性成分和质量评价研究[3].可揭示高等植物低营养耐性的机制，典型的例子包括低氮供应诱导莴苣酚类物质积累的研究[4]，以及氮水平对板蓝根幼苗叶片的影响[3]，氮磷水平对枸杞果实产量和代谢组的影响[5-6].

氮(N)、磷(P)和钾(K)被认为是植物生长、发育和产量所必需的大量营养素，它们在植物代谢的许多方面发挥着至关重要的作用[7].磷(P)是植物发育必不可少的营养物质，与光合作用、细胞能量转移和呼吸有关.一方面，缺磷会导致植物通过降低三羧酸循环中有机酸的水平[8]来改变碳水化合物代谢，从而进一步限制磷的消耗，进而阻碍植物生长、繁殖和适应不同环境的能力[9].另一方面，磷过剩可损害与淀粉[10]和其他次生代谢物(如类异戊二烯[11-12])生物合成负相关的植物性能，并降低根中硝酸盐的同化[13].然而，作为植物生长必需养分，土壤中的磷主要以不溶形式存在，无法用于植物生长.植物通过复杂的生物过程(包括磷的再利用、调节其根系结构、积累和分泌有机酸、以及创造植物根系与菌根真菌共生的能力)来应对磷的缺乏[14-15].磷肥可提高土壤肥力，确保农业生产的可持续发展[16].

柴胡的生长发育、产量和品质都受到营养需求的数量限制，营养过多或过少都会抑制柴胡的生长发育.然而，野生柴胡资源逐渐匮乏，养殖柴胡的规模越来越大，必然涉及如何充分利用植物养分.目前，受不同质量浓度P肥胁迫影响后，柴胡植株各部位中药效成分，即柴胡皂苷含量变化的研究较少.本研究对不同质量浓度P肥胁迫后柴胡各部位，即花、次茎、主茎和根中柴胡皂苷a、c和d的含量进行高效液相色谱法(HPLC)测定，探究柴胡代谢产物柴胡皂苷随环境胁迫影响的变化规律，为定向调控柴胡栽培技术，提高栽培柴胡药材质量提供科学依据.

柴胡皂苷a、c和d(纯度≥98%，四川曼思特生物科技有限公司)；
甲醇和浓氨水(为色谱纯和分析纯，哈尔滨华擎化学试剂有限公司)；
南柴胡(B.scorzonerifoliumwilld.，经黑龙江中医药大学鉴定).

梅特勒-托利多电子天平(厦门莱斯德科学有限公司)；
YRE-2010Z旋转蒸发仪(予华仪器供应旋转蒸发器)；
GL-16W台式离心机(盐城凯特实验仪器有限公司)；
SB-5200D超声波清洗机(张家港市科宇信超声有限公司)；
L-2000高效液相色谱仪和L-2200自动进样器(桂林伯乐马科技有限公司(primera scientific LLC)).

混合对照品溶液的制备：电子天平精密称量柴胡皂苷a、c和d对照品2.0、2.0和1.0 mg后，分别加入到10 mL容量瓶中.甲醇溶解后，并定容，作为混合对照品溶液.

供试品溶液的制备：分别将不同质量浓度P肥胁迫后，柴胡植株的花、次茎、主茎和根的干燥样品研碎，直至可全部通过65目筛.依照2020版《中国药典》要求[17]，取柴胡的花、次茎、主茎和根各部位粉末约500 mg，置于具塞锥形瓶中.加入25 mL甲醇溶液(含5%(V/V)浓氨).超声提取(温度30 ℃，功率200 W，频率80 kHz)0.5 h，滤过.甲醇分两次洗涤药渣和容器，将两次洗涤液及滤液合并.使用旋转蒸发仪减压回收溶剂.甲醇将残渣复溶后，定容于10 mL容量瓶中.进样分析前，取续滤液(过45 μM微孔滤膜)作为供试品溶液.

3.1 柴胡皂苷检测波长的选择

据已报道的柴胡皂苷含量测定相关文献[18]，同时确定柴胡皂苷a、c和d的最佳检测波长为210 nm.

3.2 高效液相色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(4.6×250 mm，5 μm)；
柱温为25 ℃；
流速为0.8 mL/min；
进样量为10 μL.梯度洗脱条件见表1.

表1 洗脱梯度

3.3 专属性考察

精密量取混合对照品及供试品溶液各10 μL，按色谱条件进样，对该测定柴胡皂苷a、c和d的HPLC法进行专属性考察.

图1中可见， 供试品中的柴胡皂苷a、 c和d分离度较好， 杂质对含量测定没有干扰， 表明该同时测定柴胡皂苷a、 c和d含量的方法专属性较强.

图1 供试品(A)与混合标准品溶液(B)中柴胡皂苷a、c和d的色谱图Figure 1 Chromatogram of saikosaponin a, c and d in test sample (A) and mixed standard solution (B)

3.4 标准曲线的建立

精密量取混合对照品溶液的1/2置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度.同法依次稀释5次后，制得6个质量浓度梯度的混合对照品溶液.按色谱条件测定后，以横坐标X和纵坐标Y分别表示对照品溶液的质量浓度(mg/mL)和峰面积.对混合对照品溶液中三种柴胡皂苷的测定结果各自进行线性回归.回归方程及r值结果见表2.

表2 柴胡皂苷的线性回归方程

3.5 精密度实验

将标准曲线中，最高质量浓度的柴胡皂苷a、c和d的混合标准品溶液，依照色谱条件，24 h内连续进样6次，记录所测混合对照品中柴胡皂苷各个成分的峰面积.结果见表3.

表3 精密度实验结果

3.6 回收率实验

分别精密量取同一种供试品溶液2份，再精密量取最高质量浓度的混合标准品溶液2 mL，加入到其中一份供试品溶液中.按色谱条件，两份溶液持续进样5次，并记录峰面积.通过标准曲线计算各个成分的加样回收率均值.结果见表4.

表4 回收率实验结果

3.7 重复性考察

按照供试品溶液制备方法，制备同一批柴胡样品6份，按色谱条件测定，记录各个样品的峰面积，按三种柴胡皂苷的标准曲线计算各自含量.6份供试品溶液中含柴胡皂苷a平均量(RSD)为0.62 mg/mL(1.45%)，含柴胡皂苷c的平均量(RSD)为0.72 mg/mL(1.23%)，含柴胡皂苷d的平均量(RSD)为0.38 mg/mL(1.58%).结果表明该方法的重复性满足同时测定含柴胡皂苷a、c和d量的要求.

按照色谱条件，分别记录每次测定中柴胡皂苷三种成分的峰面积，通过线性回归方程，计算每种样品中含三种柴胡皂苷各自的量(mg/g).

含柴胡皂苷量测定结果见图2，结果显示对于不施加外界干扰的自然生长的柴胡对比组中，花中3种柴胡皂苷总量最高，且含柴胡皂苷c的量最高.而对于2020版《中国药典》中柴胡质量评价的主要指标柴胡皂苷a和d，对比组中，根中含柴胡皂苷d的量远高于花、主茎和次茎部位.四个部位中含柴胡皂苷a的量都低于柴胡皂苷c和d的量.

图2 低磷(LP)、高磷(HP)胁迫下柴胡花(F)、次茎(SS)、主茎(MS)和根(R)中含柴胡皂苷a、c、d的量与对比组两年生(CP)柴胡中柴胡各部位中含皂苷量的累积对比图Figure 2 Cumulative comparison of saikosaponin a, c and d contents in flowers (F), secondary stems (SS), main stems (MS) and roots (R) of Bupleurum under low phosphorus (LP) and high phosphorus (HP) stress with saikosaponin contents in various parts of Bupleurum in two-year-old (CP) Bupleurum in the control group

施加低质量浓度的P肥(0.02 g/mL)，几乎均提高了柴胡各部位中含柴胡皂苷a的量，但对根中柴胡皂苷c的累积负向影响较大.施加高量的P肥(0.04 g/mL)对于柴胡主茎中柴胡皂苷的积累正向影响最大，大幅提高了柴胡主茎中含柴胡皂苷a、c和d的量.但对于柴胡根中柴胡皂苷d的积累有负面调节.

本研究建立的HPLC法同时测定柴胡各部位中含柴胡皂苷a、c和d量,分析方法准确、可靠.本研究比较了柴胡在高P/低P胁迫的影响下，相较于不施加外界影响的自然生长柴胡，柴胡植株中花、次茎、主茎和根四个部位中含柴胡皂苷a、c和d的量变化情况.本研究关于柴胡生长过程中柴胡皂苷积累情况的影响规律，为定向调控柴胡栽培技术和提高柴胡药材栽培质量提供科学依据.

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