犬肺表面活性蛋白A,的克隆及其在昆虫杆状病毒系统的表达

熊海凤，吴汉文，黄学婷，李 明，周 倩，崔雅倩，祁克宗，刘红梅

(兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室，安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2）引发的2019 年冠状病毒病（coronavirus disease 2019，COVID-19）已蔓延至全世界，升级为国际重大的公共卫生事件。在COVID-19 疫情下，人与动物的安全受到极大威胁。据报道，目前已从猫、雪貂、狗、水貂、金仓鼠、恒河猴、老虎和狮子等动物检测到SARS-CoV-2 核酸阳性[1-2]。对宠物犬来说，虽然其对SARS-CoV-2 的易感性较猫和雪貂低，且有部分犬能产生中和抗体[3]，但作为潜在病毒携带者对SARS-CoV-2的传播还存在不确定性[4]，因此，寻找有效防治犬感染SARS-CoV-2 的相关制剂迫在眉睫。

哺乳动物呼吸系统主要分泌4 种肺表面活性蛋白(lung surfactant protein，SP)即SP-A，B，C，D，其中SP-A、SP-D 为亲水性糖蛋白，以SP-A 含量最高，具有抗感染和免疫调节双重作用[5]。有报道机体在某些疾病状态下SP-A 和SP-D 的水平降低，如严重急性呼吸综合征，可能会增加病原感染风险和导致疾病恶化[6]。最近，人源SP-D 被多个文献证明可以结合高度糖基化的SARS-CoV-2 刺突 (S) 蛋白[7-8]，SP-D 中和SARS-CoV-2 的效应提示SP-A 和SP-D 可能在 COVID-19 中的潜在治疗前景。

目前，关于犬SP-A (canine lung surfactant protein A, cSP-A)的基因结构与功能的研究鲜有报道。本研究通过RT-PCT 方法克隆cSP-A基因并测序，分析其基因序列特征，进而利用昆虫杆状病毒系统表达cSP-A 蛋白，为进一步鉴定cSP-A 功能以及评估应用其蛋白防治SARS-CoV-2 奠定基础。

1.1 细胞及菌株

Sf9 细胞、pFastBac1 转移载体由上海兽医研究所陈鸿军研究员惠赠，DH10Bac、DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

质粒DNA 小量提取试剂盒、小鼠抗His 单克隆抗体购自上海生工生物技术有限公司，Bacmid DNA 提取试剂盒购自美国OMEGA 公司，FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 购自北京索莱宝生物科技有限公司，Trizol，HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 购自上海雅酶生物科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成

参照 GenBank 公布的cSP-A的基因序列（GenBank: M11769.1），设计相关引物见表1，引物由上海生工生物技术有限公司合成（下划线部分为酶切位点，斜体部分为引入的6×His 序列）。

表1 合成的引物序列Table 1 Synthesized primer sequences

1.4 cSP-A 基因的克隆及序列分析

采用Trizol 法提取犬肺脏组织RNA，随机引物反转录成cDNA，使用引物P1/P2 进行PCR 扩增。反应条件为：预变性95 ℃ 5 min；
变性95℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30 个循环；
完全延伸72℃ 10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化。纯化产物再连接至pMD-18T载体并转化至JM109 感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行菌液PCR 鉴定，阳性质粒送上海生工生物技术有限公司测序，鉴定正确的阳性质粒命为pMD18T-cSP-A。使用DNAMAN 软件将cSP-A序列与猪 (sus scrofa) SP-A、牛 (bovine)SP-A、小鼠 (mouse) SP-A、大鼠 (rat) SP-A、 绵羊(ovine) SP-A、人 (human) SP-A1、鸡（chicken）SP-A、鹅（goose）SP-A 的序列进行多重比对。

1.5 重组转移载体的构建

以阳性克隆pMD18T-cSP-A为模板，使用引物P3/P4 扩增cSP-A基因，在3’端引入的6×His 序列，5’端和3’端分别引入BamH I、Xhol 酶切位点。反应条件为：预变性95 ℃ 5 min；
变性95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，30 个循环；
完全延伸72 ℃ 10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化。纯化产物再经BamH I、Xhol 双酶切后连接至pFastBac1 转移载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取白色单菌落进行菌液PCR鉴定, 阳性质粒送上海生工生物技术有限公司测序，鉴定正确的阳性质粒命名为pFastBac1-cSP-A。

1.6 重组杆粒的构建

取5 μL 重组转移质粒pFastBac1-cSP-A转化至DH10Bac 感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（50 μg·mL-1）、 庆大霉素（10 μg ·mL-1）、四环素（7 μg·mL-1）及含有IPTG（40 μg·mL-1）和X-gal（20%）的LB 平板并于37 ℃培养箱培养，经三轮蓝白斑筛选后分别挑取白色单菌落及蓝色单菌落（野生型Bacmid）使用通用引物M13 进行菌液PCR 鉴定，鉴定正确的阳性杆粒命名为Bacmid-cSP-A，野生型Bacmid 杆粒命名为Bacmid-N。

1.7 重组杆状病毒的扩增及拯救

提前一天取生长状况良好且处于对数生长期的sf9 细胞铺于六孔板，待细胞生长汇合至80%左右开始转染。使用脂质体转染法，按试剂盒说明书将Bacmid-cSP-A、Bacmid-N 转入sf9 细胞，28 ℃培养箱培养。转染24 h 后每天观察细胞病变，待细胞变圆、胞核变大且大部分细胞开始脱落即可收取培养基上清，即为P1 代重组杆状病毒，命名为rBv-cSP-A，P1 代野生型杆状病毒命名为rBv-N，并于4 ℃避光保存。取200 用µL P1 代病毒液按照OMEGA 病毒DNA 提取试剂盒提取病毒DNA 进行PCR 鉴定。鉴定无误后，取适量P1 代病毒感染sf9细胞，待细胞出现明显病变后收集培养基上清，此为P2 代病毒，按照此方法继续盲传至P4 代病毒。

1.8 重组蛋白的鉴定

1.8.1 IFA 取P4 代重组杆状病毒感染72 h 后的sf9 细胞进行IFA 鉴定，以野生型杆状病毒感染的sf9 细胞作为阴性对照。吸弃培养基上清，加入预冷的4%多聚甲醛室温固定10 min，PBST 洗涤；
加入0.2% Trion×100 室温透化10 min，PBST 洗涤；
加入含2%BSA 的PBST 37 ℃封闭1h，PBST 洗涤；
加入6×His tag 鼠源单克隆抗体作为一抗37 ℃孵育1 h，PBST 洗涤；
加入FITC 标记的羊抗鼠IgG作为二抗37 ℃孵育1 h，PBST 洗涤，于荧光倒置显微镜下进行观察。

1.8.2 Western Blot 取P4 代重组杆状病毒感染72 h 后的sf9 细胞进行Western Blot 鉴定，同时以野生型杆状病毒感染的sf9 细胞作为阴性对照。细胞沉淀中加入RIPA 裂解液于冰上裂解10 min，分别向细胞裂解上清、细胞裂解沉淀中加入5×SDS PAGE蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min 后进行Western Blot鉴定，以6×His tag 鼠源单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG 作为二抗。

2.1 cSP-A 基因的克隆及序列比较

以犬肺组织cDNA 为模板，P1/P2 为引物PCR 扩增cSP-A基因。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1，可见699 bp 处单一的目的条带。目的基因经胶回收纯化后克隆至pMD-18T 载体，经酶切和测序鉴定正确，阳性质粒命名为pMD18T- cSP-A。

图1 cSP-A 基因的RT- PCR 扩增结果Figure 1 RT-PCR amplification results of cSP-A gene

分析cSP-A 肽链从N-端至C-端包含4 个结构域：10 个氨基酸残基组成的 N-末端区域；
富含羟脯氨酸，由24 个Gly-Xaa-Yaa 重复序列组成的胶原区( collagen-like domain, CLR）；
28 个氨基酸残基组成的颈部区域；
以及C 末端碳水化合物识别结域(carbohydrate binding domain, CRD)。与人SP-A1 相比，cSP-A 在N 端结构域存在1 个独有的N-糖基化位点；
而在C 端结构域，两者均存在1 个糖基化位点和9 个钙离子结合位点，而且位置也完全一致，结果如图2 所示。

图2 犬SP-A 和人SP-A1 肽链结构Figure 2 Peptide structure of canine SP-A and human SP-A1

使用DNAMAN 软件将cSP-A 与来自鸡、猪、鹅、人、小鼠、大鼠、绵羊及牛SP-A 的CRD 区氨基酸序列进行比较发现：CRD 序列全长为120 aa，不同种属间同源性为49.1%～95.5%，其中cSP-A与人SP-A1 同源性为75.5%；
不同物种间CRD 区共有 41 个位置的氨基酸残基完全保守，且在C-端附近都含有一个N-糖基化位点，但鹅和鸡除外，它们各自存在一个额外的N-糖基化位点；
大多数物种SP-A 与Ca2+结合位点有关的残基在CRD 序列中存在高度保守的WND (Trp-Asn-Asp)基序，但有2 个种属例外，其中犬为“WNN”，鸡为“WKD”，结果如图3。

图3 不同物种SP-A CRD 区氨基酸序列比对图Figure 3 Amino acid sequences alignment of SP-A CRD region in different species

2.2 重组转移载体的鉴定

以pMD18T-cSP-A为模板，使用引物P3/P4 扩增cSP-A基因，结果如图3，可见729 bp（含BamH I-Xhol 酶切位点及6×His 标签）处单一的目的条带。PCR 产物经胶回收纯化后连接至pFastBac1 转移质粒，pFastBac1-cSP-A经BamH I、Xhol 双酶切鉴定。结果如图4，可见约4 775 bp 处的载体条带及729 bp 的目的片段，同时测序结果与cSP-A基因序列完全一致，表明重组转移载体构建成功。

图4 重组转移载体pFastbac1- cSP-A 的鉴定Figure 4 Identification of the recombinant transfer vector pFastbac1- cSP-A

2.3 Bacmid-cSP-A 重组杆粒的鉴定

将构建成功的 pFastBac1-cSP-A转化至DH10Bac 感受态细胞，经过三轮蓝白斑筛选后分别挑取白色单菌落及蓝色单菌落，使用通用引物M13菌液PCR扩增。阳性重组杆粒扩增条带大小为2 300 bp+目的基因片段大小，野生型杆粒为300 bp。结果（图5）显示，阳性Bacmid-cSP-A可扩增出约 3 029 bp 条带且条带单一，野生型Bacmid-N 扩增出300 bp 条带，表明成功获得含cSP-A基因的重组杆粒且无野生型Bacmid 污染。

图5 Bacmid-cSP-A 重组杆粒的鉴定Figure 5 Identification of Bacmid-cSP-A recombinant Bacmid

2.4 重组蛋白的鉴定

2.4.1 IFA 鉴定 取P4 代rBv-cSP-A病毒感染72 h后的sf9 细胞进行IFA 鉴定。结果（图6）显示，rBv-cSP-A感染的sf9 细胞发出明亮的绿色荧光，而野生型病毒感染的sf9 细胞无可见的绿色荧光，表明重组cSP-A 蛋白在sf9 细胞中成功表达。

图6 重组杆状病毒rBv-cSP-A 的 IFA 鉴定Figure 6 IFA identification of recombinant baculovirus rBv-cSP-A

2.4.2 Western Blot 鉴定 取P4 代rBv-cSP-A病毒感染72 h 后的sf9 细胞破碎上清和沉淀进行Western Blot 鉴定。结果（图7）显示，rBv-cSP-A感染的sf9细胞破碎沉淀样品在约31.84 kDa 处有单一的特异性条带，而野生型病毒感染的sf9 细胞样品无条带，表明重组cSP-A 蛋白表达在sf9 细胞的沉淀中，没有分泌到胞外。

图7 cSP-A 基因表达产物的Western Blot 鉴定Figure 7 Western Blot identification of cSP-A gene expression product

SP-A 和SP-D 主要通过抗病原微生物感染以及免疫调节的双重功能来发挥肺部的先天免疫作用[5]。文献报道SP-A 和SP-D 可以中和多种病毒，包括甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒等[9-12]，近两年由于受新冠疫情的影响，SP-A 和SP-D因其抗病毒作用再次成为人们关注的重点[5]。据报道感染SARS-CoV-2 的重症患者血清SP-A 和SP-D 含量升高[13]，在体外人源重组SP-D 可以与冠状病毒表面的S 蛋白结合，是抑制SARS-CoV-2 感染的潜在治疗制剂[7-8]，但犬源SP-A 是否可以抗SARS-CoV-2感染还是未知。

分析cSP-A 基因序列，发现cSP-A 与人SP-A1在肽链结构、N-糖基化修饰、钙离子结合位点等方面都高度相似，但有3 处有趣的差异。首先，cSP-A的N-末端区域存在一个独有的N-糖基化位点，cSP-A 的N-糖基化修饰是否有助于其识别微生物糖基，进而增强其抗病原的功能还需要试验加以验证。其次，位于CLR 的一个离散的扭结肽序列，在人中为PCPP[14]，啮齿类动物为MGLP[15]，而犬为PGHP。该扭结肽具有构象灵活性，有助于更高阶SP-A 低聚物的形成以及CRD 结构域在空间上的分离[15-17]，这一序列在不同物种间的差异可能是基因进化的结果。最后，大多数物种（包括人）在CRD 区存在特征性基序—WND (Trp-Asn-Asp)，而犬为WNN(Trp-Asn-Asn)，虽然天冬氨酸残基（Asp）和天冬酰胺残基（Asn）都是脂肪族氨基酸，但单个氨基酸的改变有何意义还值得进一步研究。

天然SP-A 在体内主要以十八聚体形式存在，由6 个三聚体亚基组成，形成花束状结构[18]，SP-A与细胞外配体的结合依赖于颈区-CRD 三聚体和SP-A 十八聚体的高亲和性多价结合[19]，因此，如何使表达的重组蛋白形成多聚体结构对于其后续的功能研究显得尤为重要。由于昆虫杆状病毒表达系统具有外源蛋白表达量高，同时兼具糖基化及磷酸化修饰且表达的外源蛋白接近其天然结构等多种优点，故本试验采用杆状病毒表达系统表达重组cSP-A 蛋白，但试验结果表明尽管重组cSP-A 蛋白取得了较高水平的表达，但主要为细胞内表达，未能分泌到胞外，进而影响了后续的功能验证。

今后的研究中，一方面通过添加Gp64 信号肽促进cSP-A 蛋白的分泌表达，另一方面尝试在N 端加入柔性肽序列从而将两个cSP-A 基因进行串联表达，促进多聚体的形成，以期得到具有高亲和力的重组cSP-A 蛋白。

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