弓形虫RH株感染比格犬动物模型的建立*

问婉欣 陈洪岩 韩凌霞

(中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队 兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室 国家禽类实验动物资源库，哈尔滨 150069)

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii,T.gondii)引起的一种人兽共患寄生虫病，呈世界性分布，在哺乳动物、鸟类、贝类、鱼类等多种动物体内发现，可在有核细胞内寄生，对宿主造成全身性损伤。弓形虫病感染模型是防治弓形虫病的重要条件，已报道的弓形虫病感染模型，包括小鼠[1-13]、大鼠[14-16]、猪[17-19]、山羊[20-21]、鸡[22]、猫[23]和犬[24]等。除啮齿类外，其他感染用动物都不是标准的实验动物，因此得到的临床表现和实验结果不尽相同，不利于弓形虫病的进一步研究。

犬由于特殊的舔舐行为，容易接触含有弓形虫卵囊的土壤，是重要的自然感染宿主，随着宠物犬的数量越来越大，建立犬弓形虫发病模型对研究和防治犬弓形虫病的意义愈加明显[25]。本研究采用经过生物学净化的实验用比格犬，在负压II级动物生物安全等级实验室进行了弓形虫感染实验，以期建立弓形虫感染犬的发病模型。

1.1 材料

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所贾洪林研究员提供，利用Vero E6细胞系增殖和保存。无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)级76日龄雄性比格犬5只，由青岛博隆实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK(鲁)2017-0006。犬弓形虫特异性血清抗体阴性【利用中国农业科学院兰州兽医研究所提供的弓形虫间接血凝试验(IHA)试剂进行检测】。感染实验在青岛澳兰百特生物科技有限公司【SYXK(鲁)2017-0013】的动物生物安全等级II级实验室进行。本实验经过该单位的实验动物使用福利伦理审查，伦理审批号：OLBT20191201，实验结束后的动物残体经无害化处理。Premix Ex Taq(Probe qPCR)、pMD18-T(TaKaRa公司)；
FastPure GeL Extraction MiniKit(Vazyme公司)；
EndoFree Maxi Plasmid Kit、血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒【天根生化科技(北京)有限公司】。

1.2 方法

1.2.1弓形虫感染犬实验：将5只76日龄SPF级比格犬分为2组：实验组3只，编号分别为9190#、9192#、9196#，接种弓形虫时体质量分别为1.5 、1.5和0.95 kg；
对照组2只，编号分别为9093#和9098#。在负压屏障环境下分别饲养于两个房间，采用离地式畜栏饲养，饲料来自青岛博隆实验动物有限公司。实验组每只腹腔注射1.5×107个弓形虫速殖子，对照组接种等体积的灭菌PBS。接种后每日8时和14时利用兽用电子测温计测量直肠温度各1次，采集咽拭子和肛拭子各1次，用于检测弓形虫的B1基因。8 d后结束实验，称量体质量，前肢肌肉注射舒泰®50深度麻醉所有犬，经瞳孔观察和肌肉反射检查，确认动物死亡后，剖检，采集部分肝、脾、肺、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、腹水、肾和大脑等组织，置于-20 ℃保存，用于提取基因组DNA进行弓形虫核酸定量检测；
另取部分组织立即置于甲醛溶液，用于制备石蜡切片，进行苏木精-伊红(HE)染色。以弓形虫抗猪高免血清为一抗(中国农业科学院兰州兽医研究所提供)，HRP标记抗猪IgG为二抗，对感染犬的肝组织石蜡切片进行免疫组织化学检测。

1.2.2犬咽拭子和肛拭子中弓形虫B1基因的PCR检测：利用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照产品使用说明书，提取实验犬咽拭子和肛拭子中的基因组DNA。根据参考文献[26]合成弓形虫B1基因特异性引物，引物序列为：TPG1∶5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′，TPG2：5′-ACGG ATGCAGTTCCTTTCTG-3′。扩增产物大小为580 bp。PCR反应体系为：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 10 μL、TPG1 和TPG2 各1 μL(10 μmoL/L)、模板1 μL、ddH2O 7 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃ 延伸5 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶进行核酸电泳，电泳结果在凝胶成像系统(SmartGelTMImage Analysis System)记录并保存。

1.2.3犬不同组织中弓形虫Rep 529 nt定量PCR 检测：根据弓形虫Rep 529 nt 重复片段建立荧光标记实时定量PCR方法[27]。引物Rep529F序列为：5′-GTTGGGAAGCGACGAGAGTC-3′，Rep529R：5′-ATTCTCTCCGCCATCACCAC-3′，探针序列为 5′-FAMAGAAGATGTTTCCGGCTTGGCTGCTTTAMRA-3′。先扩增Rep529 nt，构建重组质粒，反应体系为：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25 μL、Rep529F和Rep529R各2.5 μL(10 μmoL/L) 、模板5 μL、ddH2O 15 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃ 延伸5 min。常规方法克隆至pMD18-T载体，构建重组质粒，经吉林省库美生物技术有限公司测序鉴定。将质粒利用紫外分光光度计测定浓度，连续10倍稀释，每个稀释度3次重复，绘制荧光定量PCR反应标准曲线。定量PCR反应体系为Premix Ex Taq 10 μL、Rep529F 和Rep529R各0.4 μL(10 μmoL/L) 、探针 0.8 μL、模板 2 μL、去离子水 6.4 μL。定量PCR反应程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。使用QuantStudio 5荧光定量PCR仪对结果进行分析，绘制标准曲线。根据产品使用说明书，提取犬不同组织中的基因组DNA，测定浓度和纯度后，检测弓形虫Rep529 nt重复片段的拷贝数。每个被检样品设3个重复。

2.1 犬感染弓形虫后的临床症状

攻毒犬和对照犬的食欲和精神状态均无明显异常。实验犬感染弓形虫后第3天，犬9192#和9196#的眼角出现少量分泌物；
4 dpi至6 dpi时，9190#的鼻镜表观发干；
随着病程延长，逐渐出现腹泻，6 dpi时全部为稀便。攻毒犬8 d的平均体温、最低温度和最高温度均高于对照犬，在4 dpi或5 dpi达到39.0 ℃，攻毒时体温(0 dpi)及攻毒后的体温变化见图1。

图1 犬接种弓形虫后的体温变化Fig.1 Body temperature curves ofT. gondii-infected dogs

2.2 拭子中弓形虫B1基因的PCR检测

对咽拭子和肛拭子中的弓形虫核酸进行检测，结果表明，攻毒犬在1 dpi即能从犬9192#的肛拭子中扩增出阳性条带，接着从咽拭子和肛拭子中扩增条带，最后的阳性检出样品是6 dpi犬9192#的肛拭子。所有的样品中肛拭子的阳性率高于咽拭子，3 dpi时阳性样品的数量最多，对照犬PCR结果阴性，见表1。

表1 感染犬的口腔拭子和肛拭子中弓形虫核酸的PCR检测结果Table 1 PCR results in the oral and anal samples of T.Gondii-infected dogs

2.3 大体病变及病理组织学检测结果

接种8 d后，感染犬体温正常，无明显临床症状，结束实验。剖检发现，3只攻毒犬均产生不同程度的腹水，清亮无异味或呈棕色(图2A)。组织学检测结果表明，感染犬的肝(图2B)细胞大量变性坏死，伴有局灶性炎性细胞浸润；
肾小管(图2C)上皮细胞部分变性，少量坏死；
扁桃体、肠系膜淋巴结均出现巨噬细胞轻度增生，脾出现局灶性含铁血红素沉积，胰腺有少量腺泡细胞变性，嗜碱性增强。卵巢、盲肠、十二指肠、回肠和直肠无明显异常。对照犬未见异常。以弓形虫抗猪高免血清为一抗，对9196#犬的肝脏进行免疫组化检测，未见明显特异性显色(图2D)。

注：A：感染犬腹腔腹水；
B：感染犬肝；
C：感染犬肾；

D：感染犬肝的弓形虫特异性免疫组化Note：A: ascite in infected caine; B: infected liver; C: infected kidney; D:IHC result of infected liver图2 犬感染弓形虫后的大体病变和病理组织学变化Fig.2 Gross changes and histopathological observations of T.Gondii-infected dogs

2.4 不同组织中弓形虫核酸拷贝数的定量检测

构建成功重组质粒pMD-Rep529。以质粒的拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制曲线，获得标准曲线方程：y=-4.642x+54.498，相关系数(r2)为0.995。感染8 d后对犬安乐死，对犬的主要组织脏器中含有的弓形虫核酸拷贝数进行定量比较，结果表明弓形虫主要存在于肠系膜淋巴结、肝和盲肠，见图3。

图3 感染犬不同组织中弓形虫核酸拷贝数Fig.3 Nucleotide copies of T. gondii in various tissues of the infected dogs

弓形虫为胞内寄生虫，对寄生的细胞类型没有选择性，临床症状因受感染的细胞不同而出现不同的反应。健康成年动物表现为亚临床，幼年动物因多种组织器官的炎性反应表现出发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻、黄疸、癫痫甚至死亡。自然感染途径为消化道感染成熟卵囊致病，但只有在猫体内才能形成裂殖体、配资体和卵囊的形态，因此弓形虫感染模型较难完全复制出自然感染症状。

实验用比格犬来自人工哺乳、隔离器内喂养生长，生物进化的比格犬，其亲代在人流、物流和气流环境受到严格控制，按照GB 14922.2—2011《实验动物微生物等级及监测》的规定免疫了狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒和犬传染性肝炎疫苗，在遗传背景、携带病原体、饲料营养等方面的个体差异较小。感染实验设施为屏障环境。采用腹腔接种体外培养的速殖子的方式，以尽量准确计数速殖子数量，但因此有可能降低了对犬的致病性。

感染犬出现一过性发热，在4 d左右体温升高至39 ℃，持续1～2 d恢复至正常。有报道[24]4只腹腔接种104个RH株速殖子犬的体温在7至14 d后略有升高，只有1只犬出现食欲减退、腹泻和呼吸急促，55 d后死亡，另3只犬直到62 d仅出现中度症状。与本实验结果相似。利用肉鸡人工腹腔接种1×108、1×107或1×106个JS株速殖子后2 d，直肠温度也短时升高[22]。啮齿类动物感染模型的报道未提供体温数据，或许与发热时间短不易观察有关。结果表明单因子弓形虫感染，会短时温和升高动物体温。

轻度短时腹泻是弓形虫感染的另一个症状。本实验中比格犬在接种后先后出现腹泻，6 d时观察到的粪便全部为稀便(每日两次清除粪便)，之后稀便的比例逐渐减少，至8 d时恢复正常。与组织病理学检测结果犬的十二指肠、回肠、盲肠和直肠未见明显异常相符合。但大鼠口服5 000个ME-49株卵囊后观察到肠黏膜下层和肌层萎缩，肠细胞高度降低，杯状细胞增多，十二指肠的变化与感染时间成正比[15]。

本研究中3只感染犬均出现少量腹水，呈暗红色或透明无色，清亮不浑浊。组织学检测结果，肝细胞出现大量变性坏死，伴局灶性坏死，炎性细胞浸润，与已报道的弓形虫感染结果一致，例如门静脉和中央静脉周围淋巴细胞浸润[16]，局灶性充血、变性和坏死[28]，肝窦增大[22]，在个别细胞中抗原呈阳性[28]。但没有观察到明确的由宿主细胞膜包绕而成的假包囊，也未见明显的虫体自身分泌物形成的包囊，可能与感染后时间较短(8 d)，或者宿主(SPF级幼犬)相对于体外滋养体的抵抗能力较强有关。肺脏也易引起病变[16,22,28]，本研究中感染犬的扁桃体仅出现轻微增生。定量PCR检测结果标明，弓形虫在宿主体内的分布没有明显的组织特异性。

制备疫病感染模型标准的关键是标准化病原体和宿主。中等毒力弓形虫毒株常造成隐性感染，RH株是代表性强毒株。利用SPF级比格犬腹腔接种弓形虫RH株，主要引起一过性体温升高和明显的短时腹泻，导致肝组织变性和坏死，对肠道无明显损伤，粪便相比于口腔是更重要的排虫方式。

弓形虫基因型众多，人犬共感染情况不容忽视，建立弓形虫感染犬发病模型对防治犬弓形虫病具有一定的提示作用。

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