多重杂质吸附结合液相色谱串联质谱测定宠物饲料中牛磺酸

索德成， 肖志明， 王 石， 王继彤， 姚 婷， 刘晓露， 范 理， 樊 霞*

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；
2.北京市兽药饲料监测中心，北京 100101）

牛磺酸（Taurine）又称β-氨基乙磺酸，是一种含硫的非蛋白氨基酸，作为机体的条件必需氨基酸，多以游离态广泛存在于动物体内各组织器官，并以小分子二肽或三肽的形式存在于中枢神经系统，具有多种生理活性和营养作用（李卫娟等，2006；
刘惠芳等，2003）。牛磺酸虽然不直接参与机体蛋白质合成，但其可通过影响胱氨酸和半胱氨酸的代谢从而参与新陈代谢（何晓芳等，2022）。人和一些动物机体可以从膳食中摄取或经自身合成牛磺酸，但对于犬猫等动物特别是猫科动物来说，体内不能合成牛磺酸，只能依靠从外界摄取（李卫娟等，2006；
黄天珍，1994）。如果猫没有获得足够的牛磺酸，会出现如视网膜退化、视力衰退、扩张型心肌症消化疾病、生殖功能衰竭、免疫功能失调、发展迟缓等健康病症（吴兴利等，2006；
赵建伟等，1999；
黄天珍，1994）。因此，宠物饲料生产过程中会额外加入牛磺酸以保证动物机体的健康生长，我国农业农村部公告第20号中的《宠物饲料标签规定》也将牛磺酸作为产品标签中成分分析保证值的强制性标示参数。

目前宠物饲料中牛磺酸的检测分析与食用动物饲料采用的方法一致，主要包括比色法（李咏梅等，2013；
杨涓等，2005）、高效液相色谱法（殷秋妙等，2016；
杨曦等，2014、2013；
张晓凤等，2012）、氨基酸分析仪测定法（王洪健等，2012）等，其中高效液相色谱法是最常用的检测方法，但其检测过程需要使用丹磺酰氯、邻苯二甲醛、二硝基氟苯等进行衍生，操作复杂；
此外，宠物饲料成分复杂，动物源性原料如肉类、动物油脂类含量高，与传统食用动物饲料基质存在较大差别，提取后杂质干扰大，影响衍生效率和色谱定量，检测重复性差，无法满足宠物饲料中牛磺酸的准确定量要求。液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）灵敏度高，选择性和特异性好，近年来已被广泛应用于氨基酸类化合物检测（陈晓峰等，2015；
邓其馨等，2014；
李鹏飞等，2013、2012）。配合多重杂质吸附技术可在前处理过程中净化宠物饲料基质中的杂质干扰。本实验旨在建立多重杂质吸附结合LC-MS/MS定性定量分析宠物饲料中牛磺酸的方法，为复杂的宠物饲料基质中牛磺酸的检测分析提供技术参考。

1.1实验材料 宠物饲料样品由国家饲料质量检验检测中心（北京）提供，固体样品全部粉碎过0.45 mm孔径筛，所有样品全部混合均匀。

盐酸（分析纯，北京化工厂）；
甲酸、乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher ChenAlert Guide公司）；
牛磺酸对照品（纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司）；
实验用水为Milli-Q纯化后的一级水（＞18.2 MΩ）。

前处理吸附材料：Cleanert S C18（粒径50 μm）、Cleanert S中性氧化铝（Alumina-N，粒径150 μm）、Cleanert S活性碳（PestiCarb，粒径120~400 mesh）、Cleanert S Nano Carb（粒径10~20 nm），均购置于Agela Technologies公司；
BONDESILSAX（粒径40 μm）、BONDESIL-SCX（粒径40 μm）、BONDESIL-PSA（粒 径40 μm）、BONDESIL-FL（粒径200 μm，均购置于美国Agilent Technologies公司）。

1.2仪器和设备Acquity超高效液相色谱：配备TQS三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；
MS2漩 涡 混 合 器 （德 国IKA公 司）；
Centrifuge 5810离心机（德国Ependorf公司）。

1.3实验方法

1.3.1 样品稀释溶液 移取0.1 mL甲酸和10 mL乙腈，加水定容至100 mL。

1.3.2 标准溶液配制 准确称取牛磺酸对照品，置于棕色容量瓶中，用水配成浓度约为100 mg/mL的标准贮备液；
再准确吸取牛磺酸贮备液，用样品稀释溶液稀释成浓度为0.01~10 μg/mL的标准工作液。

1.3.3 多重吸附前处理吸附材料的配制 称取10 g C18吸附材料，15 g中性氧化铝吸附材料，10 g活性碳吸附材料于50 mL三角瓶中，混合均匀。

1.3.4 样品前处理 准确称取2.0 g（精确至0.001 g）样品，置于50 mL离心管中，准确加入20 mL 0.5 mol/L盐酸溶液，超声提取30 min，然后于8000 r/min离心2 min，取2 mL上清液置于5 mL离心管中，加入50 mg多重吸附前处理吸附材料，漩涡混合30 s，于8000 r/min离心2 min。将1 mL上清液转移至10 mL离心管中，加入9 mL水，漩涡混合30 s，过0.22 μm滤膜，供LC-MS/MS分析测定。若样品中含量超出线性范围，应用样品稀释液稀释至线性范围后再进行上机分析。

1.4色谱质谱条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×3.0 mm×1.7 μm）；
流速：0.3 mL/min；
柱温：30℃；
进样量：5 μL；
流动相及参考梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相及梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件 质谱采用电子喷雾离子源，正离子检测方式，多反应监测（HRM）模式；
喷雾电压为3.0 Kv；
雾化气温度为480℃；
源温度为150℃；
雾化气流速为600 L/hr；
锥孔气流速为5 L/hr；
脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

2.1流动相的优化 参考邓其馨等（2014）、李鹏飞（2013）和标准方法（GB 5009.169-2016和农业部2483号公告-5-2016），分别选择乙腈和甲醇作为流动相进行实验。结果表明，当使用甲醇作为流动相的时候，在相同的条件下，离子化将受到不同程度的抑制，响应值将会明显的降低，导致灵敏度的下降；
而使用乙腈作为流动相时，离子化效率明显优于使用甲醇作为流动相的情况，所以本实验采用乙腈为流动相。使用优化流动相的典型色谱图见图1。

图1 牛磺酸标准溶液（10 μg/mL）色谱质谱图

2.2监测离子对的选择 监测离子对是串联质谱仪定性、定量的必要参数，因仪器型号不同而略有改变。以牛磺酸的标准溶液在ESI源正离子模式下扫描，选出信号相对较强的两个碎片离子与其母离子分别组成两对监测离子对，在UPLC-MS/MS仪器的MRM模式下，实施对于锥孔电压与碰撞能量等参数的进一步优化，优化过后得到的MRM离子对和质谱条件见表2。

表2 牛磺酸质谱参考值

2.3样品前处理方法的确定

2.3.1 提取液及提取方式的选择 由于牛磺酸是水溶性物质，一般采用水溶液提取，但由于宠物饲料中蛋白质、脂肪类物质含量较高，简单用水提取后，不能将牛磺酸和蛋白质、脂肪类物质有效分离，会影响检测结果，故需要对前处理提取溶剂进行筛选。蔡梅等（2013）研究发现，采用酸水解后将样品基质中的蛋白质和脂肪等转变为水溶性物质，可以提高回收率，但是过高的酸会影响检测结果。因此，本实验比较了0.2~6 mol/L HCl溶液的提取效果，根据实验结果，最终选择0.5 mol/L HCl作为提取液对样品进行提取，回收率和相对标准偏差均能满足方法学需要。确定了提取溶剂后，比较振荡提取和超声波提取对牛磺酸提取效率的影响，对结果进行分析发现，2种提取方法无明显差异。但为了节约时间，最终选用超声处理。脂肪量低样品或液体样品中牛磺酸的测定可用水提取或直接加水稀释后测定。

2.3.2 净化吸附材料的选择 本实验选择8种吸附材料（表3）对宠物饲料中的牛磺酸进行吸附实验。称取宠物饲料样品25 g，加入100 mL提取液，离心，转移至试剂瓶中。分别吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL牛磺酸标准溶液和50 mg吸附材料（材料比例），漩涡混合30 s，在摇床上振荡10 min，离心5 min，取上清液过膜，上机检测。同时吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作为空白参考。用样品溶液测定值与空白参考测定值的百分比值作为吸附率，吸附结果见图2。

表3 吸附材料名称与类型

图2 不同吸附材料对宠物饲料中牛磺酸的保留率

结果表明，除了C18、Alumina和石墨碳外，其他大部分吸附材料对牛磺酸有一定的富集，但是其对牛磺酸吸附率均低于100%，无法作为富集材料使用。多重机制杂质吸附（MIA）是一种基于基质分散固相萃取的方法，该方法主要通过选择多种功能化吸附材料，将样品中的主要干扰杂质吸附，有效地去除基体中可能存在的磷脂、色素等物质，同时将被测物质留在样品溶液中，而达到净化和富集的目的，可节省样品前处理的时间（Suo，2021）。因此，选择C18、Alumina和石墨碳作为多重机制杂质吸附材料进行下一步的研究。

2.3.3 前处理材料的比例和使用量的研究 根据不同材料的吸附特性，如石墨碳主要是物理性吸附，主要吸附气体、色素类物质；
C18吸附填料主要吸附磷脂和中等极性的化合物；
中性氧化铝是物理性吸附，主要去除油脂类的类物质。通过混合使用可以有效的去除宠物饲料的各种杂质干扰，达到更好的净化效果。从基质净化效果来看，石墨碳、C18和中性氧化铝的比例为2∶2∶3，能有效地吸附杂质，降低基质效应。

本研究同时考察了吸附材料的使用量，比较了5、10、20、50、80、100 mg不同固体吸附剂加入量对2 mL饲料提取液中杂质净化效果的影响。结果表明，当固体吸附材料加入量达50 mg时，继续加大吸附剂的用量对样品杂质的净化效果和回收率无明显改善。因此将吸附材料加入量设定为50 mg。当加入吸附剂吸附净化后，可以有效地除去基质中的干扰物对待测物色谱峰的影响，同时减少杂质对仪器和色谱柱的损害。

2.4线性、检出限和定量限 根据1.4.2配制标准溶液并上机测定，根据3倍信噪比确定检出限（LOD）、10倍信噪比确定定量限（LOQ），牛磺酸的标准曲线、检出限和定量限见表4。

表4 牛磺酸的标准曲线、检出限和定量限

2.5回收率和精密度 在确定样品前处理方法后，选择有代表性的6种空白宠物饲料样品作为研究对象，进行加标回收实验，以考察方法的准确度和重现性。配制10、100 mg/kg和500 mg/kg三个浓度的试样，每批次内同一浓度做6次平行实验，共重复3批次，实验结果见表5。

表5 不同宠物饲料添加回收结果 %

从表5中可以看出，建立的检测方法回收率＞85%，相对标准偏差＜10%，该方法可适用于不同种类宠物饲料中牛磺酸含量的测定。

2.6实际样品分析 基于以上条件建立的检测方法，对从市场上采集到的20份不同的宠物饲料样品进行检测，检测结果见表6。大部分牛磺酸的测定结果比标示值高，其原因可能是企业考虑到牛磺酸添加后的不稳定因素，为了保证终产品中牛磺酸满足标识量要求，一般在设计配方和实际生产时会适当超出一定量添加牛磺酸，导致样品的检测结果高于产品标示值。

表6 典型宠物饲料中牛磺酸检测结果

本研究中通过对前处理条件及仪器条件参数进行优化，建立了多重机制杂质吸附萃取净化结合液相色谱串联质谱技术测定宠物饲料中牛磺酸的方法，该方法可满足宠物饲料中牛磺酸的分析要求，且操作简便、分析效率高，可用于相关样品的日常检测及监控分析。

猜你喜欢 牛磺酸杂质质谱 牛磺酸的吸收与代谢方式及其在动物生产中的应用研究进展中国畜牧杂志(2022年5期)2022-11-06牛磺酸真有用吗？电脑报(2022年25期)2022-07-05临床医学质谱检验技术质量管理研究现代仪器与医疗(2022年1期)2022-04-19气相色谱质谱联用仪在农残检测中的应用及维护食品安全导刊(2021年20期)2021-08-30基于两种质谱技术检测蛋白酶酶切位点的方法现代仪器与医疗(2021年2期)2021-07-21剔除金石气中的杂质,保留纯粹的阳刚之气艺术品鉴(2020年6期)2020-12-06牛磺酸， 猫和人都需要的营养素食品与健康(2020年7期)2020-07-09猫为什么要捉老鼠？阅读与作文（小学高年级版）(2019年2期)2019-03-27顶空—固相微萃取—全二维气相色谱—飞行时间质谱测定水中短链氯化石蜡分析化学(2018年12期)2018-01-22二则领导文萃(2017年6期)2017-03-24

推荐访问:牛磺酸 色谱 串联