人参皂甙Rg3对脓毒症小鼠炎症反应及淋巴细胞内Cleaved,Caspase-3蛋白的影响

李青青 贾雅楠 丁怿虹 陆刚 唐建国 张学敏

脓毒症是宿主对感染的一种失控反应，常常导致严重的多器官功能障碍。脓毒症是急诊、ICU、老年科等科室急重症患者主要死亡原因之一。脓毒症治疗现在多以抗生素为基础，同时治疗原发疾病，治疗周期长、费用高，给患者造成很大的经济负担。脓毒症患者晚期常存在免疫抑制或免疫麻痹，针对脓毒症的免疫应答机制研究及免疫反应调控的药物探寻具有重要意义[1]。免疫功能监测指导下的免疫调节治疗可能为改善脓毒症预后开辟一种新的途径。

人参为五加科多年生草本植物，人参皂甙Rg3是人参的有效成分，是从人参中提取的四环三萜类人参二型皂甙单体。人参皂甙Rg3本身是免疫增强剂，能增强人体对炎症的抵抗作用[2]。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激模拟脓毒症状态小鼠，观察人参皂甙Rg3对脓毒症状态小鼠炎性因子水平、脾脏指数及淋巴细胞内裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Cleaved Caspase-3）蛋白表达的影响，来探讨人参皂甙Rg3对脓毒症小鼠炎症反应的保护作用及淋巴细胞凋亡的影响。

1.1 主要试剂及仪器 小鼠TNF-α试剂盒（批号：TNDE1021am）、IL-6试剂盒（批号：16NV1021m）、IL-1β ELISA试剂盒（批号：I1FE1021bm）均购自加拿大ANOGEN公司；
LPS购自上海环硕生物科技有限公司；
人参皂甙Rg3购自成都曼思特生物科技有限公司；
Cleaved Caspase-3兔单克隆抗体（批号：3）购自美国Cell Signaling公司。酶标仪（型号：318C+）购自上海市沛欧分析仪器有限公司；
电热恒温水槽（DK-420）购自上海精宏实验设备有限公司电泳仪；
转膜仪（型号：DYCZ-40D）购自北京市六一仪器厂；
荧光及化学发光成像系统（型号：ChemiScope 6100）购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2 实验动物 SPF级BALB/c雄性小鼠40只，6～8周龄，体重18～23 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（沪）2014-0008。所有小鼠饲养在温度和湿度受控的动物房中，具有12 h/12 h的光/暗循环，小鼠自由进食与饮水。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准，经复旦大学实验动物科学部动物福利和伦理小组批准。

1.3 分组及模型制备 采用区组随机法将小鼠分为对照组、人参皂甙Rg3组、LPS组、人参皂甙Rg3+LPS组，每组10只。其中LPS组、人参皂甙Rg3+LPS组小鼠通过腹腔注射LPS的方法制备脓毒症模型。对照组用0.3 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续7 d，第4天腹腔注射0.3 ml 0.9%氯化钠注射液；
人参皂甙Rg3组将人参皂甙Rg3按30 mg/kg溶于0.3 ml 0.9%氯化钠溶液后，灌胃，1次/d，连续7 d，第4天腹腔注射0.3 ml 0.9%氯化钠注射液；
LPS组用0.3 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续7 d，第4天腹腔注射0.3 ml LPS溶液（15 mg/kg LPS溶于0.3 ml 0.9%氯化钠注射液）；
人参皂甙Rg3+LPS组将人参皂甙Rg3按30 mg/kg溶于0.3 ml 0.9%氯化钠溶液后，灌胃，1次/d，连续7 d，第4天腹腔注射0.3 ml LPS溶液（15 mg/kg LPS溶于0.3 ml 0.9%氯化钠注射液）。

1.4 检测指标及方法 第7天所有小鼠用0.3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，剪开腹腔，通过腹主动脉采血，取血置于塑料离心管中，室温离心分离出血清（3 000 r/min，10 min），取上层血清-70℃保存，用于测定炎性因子水平；
然后采用颈椎脱臼法处死小鼠，取出脾脏，计算脾脏指数；
将脾脏剪成小块，研磨过200目筛网，收集细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞置入冻存管-70℃保存，用于检测蛋白表达。

1.4.1 血清炎性因子水平测定 取出血清后4℃复融，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.4.2 脾脏指数检测 将小鼠的脾脏结缔组织剪除，用滤纸吸净表面的血液，用分析天平称重，按以下公式计算出脾脏指数：脾脏指数=脾重量（mg）/体重（g）×10。

1.4.3 Cleaved Caspase-3蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取出淋巴细胞，解冻后用裂解液裂解，提取组织蛋白，应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质分离，上样后在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，以电转膜方法将蛋白质转移至醋酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，加入相关一抗孵育，4℃振荡过夜，次日5%磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗膜，加入对应二抗孵育，振荡1 h，5%PBST洗膜，置于显影仪中曝光显影。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，用凝胶分析软件Quantity One分析Cleaved Caspase-3蛋白条带灰度值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 4组小鼠血清炎性因子水平比较 与对照组比较，LPS组、人参皂甙Rg3+LPS组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高（均P＜0.05）；
与LPS组比较，人参皂甙Rg3组、人参皂甙Rg3+LPS组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低（均P＜0.05），见表1。

表1 4组小鼠血清炎性因子水平比较（pg/ml）

2.2 4组小鼠脾脏指数比较 与对照组比较，LPS组、人参皂甙Rg3+LPS组小鼠脾脏指数均升高（均P＜0.05）；
与LPS组比较，人参皂甙Rg3组、人参皂甙Rg3+LPS组小鼠脾脏指数均降低（均P＜0.05），见表2。

表2 4组小鼠脾脏指数比较

2.3 4组小鼠脾脏淋巴细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较 与对照组比较，LPS组、人参皂甙Rg3+LPS组小鼠Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）；
与LPS组比较，人参皂甙Rg3组、人参皂甙Rg3+LPS组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均降低（均P＜0.05），见图1、表3。

表3 4组小鼠淋巴细胞内Cleaved Caspase-3/β-actin蛋白灰度值比较

脓毒症的发病过程涉及到复杂的全身炎症反应、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤等多个方面，它可以由任何部位的感染引起。脓毒症常常发生在原有慢性疾病或年老体衰、外科手术后等患者。LPS刺激是制作动物脓毒症模型的一种常用方法，本研究采用LPS腹腔注射模拟脓毒症状态小鼠，小鼠均在刺激后逐渐出现竖毛、萎靡、腹泻、饮食及活动次数减少，几天后症状才逐渐缓解好转。

机体发生脓毒症时感染因素可激活机体单核巨噬细胞系统及其他炎症反应细胞，产生并释放大量炎性因子，脓毒症期间TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平均会升高[3-5]，它们的协同作用被喻为是细胞因子诱发病理生理级联反应的扳机，抑制脓毒症的炎症，可以降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平[6]，通过检测这些炎性因子的动态变化可以在一定程度上反映体内炎症的严重程度。本实验中，小鼠腹腔注射LPS，刺激后3 d炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平和脾脏指数均高于对照组，而给予人参皂苷Rg3灌胃处理后小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平和脾脏指数均低于LPS组，提示人参皂甙Rg3能减少脓毒症小鼠炎性因子分泌，降低炎症反应。

淋巴细胞凋亡是脓毒症患者免疫抑制的主要原因，脓毒症时机体大量淋巴细胞会发生凋亡，脓毒症诱导的免疫抑制的主要特征包括T细胞功能障碍，其特征是脾脏T细胞凋亡，分化抗原4叉头翼状螺旋转录因子调节性T细胞（CD4 FoxP3 Tregs）升高，Th1免疫反应抑制[7]，高水平的T淋巴细胞凋亡不仅导致大量免疫效应细胞的丢失，而且会激活多种信号通路，导致机体内免疫系统受到明显抑制，因此减少T淋巴细胞的凋亡可以改善机体的免疫功能，提高脓毒症患者的生存率[8]。既往研究表明脾脏中淋巴细胞凋亡状况与炎症的严重程度和预后密切相关[9]，28 d内死亡的脓毒症患者外周血淋巴细胞凋亡百分比明显高于存活患者，死亡患者体内淋巴细胞计数明显低于存活患者[10]。

多种凋亡途径最终激活凋亡执行分子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3），Caspase-3在正常情况下以酶原的形式存在，当细胞发生凋亡时，Caspase-3会被活化成为Cleaved Caspase-3，发挥促进细胞凋亡的作用[11]。Ibrahim等[12]通过实验证明盲肠结扎穿孔术后的大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、NF-κB水平升高，凋亡介质Caspase-3和p-JNK蛋白表达上调，通过非布索坦治疗后，各测量参数均有明显好转，此外，还能改善组织病理变化，提高整体存活率。本实验中，小鼠腹腔注射LPS，刺激后3 d小鼠脾脏淋巴细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平高于对照组，而给予人参皂苷Rg3灌胃处理组小鼠的Cleaved Caspase-3蛋白表达水平低于LPS组，提示人参皂甙Rg3有减少小鼠脓毒症时淋巴细胞凋亡的作用。

既往研究发现人参皂苷Rg3能通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路调节线粒体自噬，改善线粒体功能障碍，保护脓毒症引起的细胞和器官损伤[13]。人参皂苷Rg3能通过NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路发挥强抗炎效果，抑制一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶-2、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达[2]。

综上所述，本实验通过检测人参皂苷Rg3对脓毒症小鼠炎性因子及Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响，提示人参皂苷Rg3具有降低脓毒症小鼠炎性因子水平、脾脏指数及凋亡相关蛋白Caspase-3活化水平的作用。本研究为动物实验，存在一定的局限性和不足之处，为进一步探讨其机制需进一步深入研究，同时在临床上的有效性需要通过临床试验去验证。

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