通过式固相萃取柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定人全血中环孢素A和他克莫司的含量

杨 飞 ,纪 元 ,王 颖 ,范子彦 ,唐纲岭∗

(1.国家烟草质量监督检验中心,郑州 450001;2.山东省食品药品检验研究院,济南 250101)

环孢素A 和他克莫司均是临床上经常使用的强效免疫抑制剂,在服药后,血药浓度水平与免疫抑制程度以及肝肾毒性密切相关。环孢素A 和他克莫司的治疗窗口狭窄,环孢素A 的推荐治疗血药质量浓度在术后1个月内为250～450μg·L－1,1～3个月内为250～400μg·L－1,3～6 个月内为180～400μg·L－1,6～12个月内为150～300μg·L－1,12个月后为100～250μg·L－1[1];他克莫司的推荐治疗血药质量浓度在术后1个月内为15～20μg·L－1,2～3个月内为10～15μg·L－1,3个月后为5～10μg·L－1[2]。因此,需要对患者的血药浓度水平进行监测,进而根据患者自身情况调整免疫抑制剂的用量[3-4]。

血液中环孢素A 和他克莫司的检测方法主要有免疫分析法[5-6]、高效液相色谱法(HPLC)[7-8]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9-13]。免疫分析法试剂昂贵、操作繁琐,且无法同时分析两种及两种以上药物。HPLC 耗时较长,不适用于大规模临床样本的检测。LC-MS/MS的选择性高,是分析免疫抑制剂的常用方法,已广泛应用于血液中环孢素A 和他克莫司的检测。血液基质复杂,含有大量的脂类、蛋白质等,在采用LC-MS/MS 测定前,需要通过固相萃取等方法净化[10,14]。PRi ME HLB通过式固相萃取柱是一种新型的亲水亲油平衡固相萃取柱,不需要活化、清洗柱子等步骤即可在重力作用下净化样品[15-18],但是尚未发现它在人全血中环孢素A 和他克莫司检测中的应用。为此,本工作以PRiME HLB 通过式固相萃取柱净化样品,以高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定人全血中环孢素A 和他克莫司的含量,方法操作简单、快速、准确,灵敏度高且特异性强,适用于实验室中大批量样品的快速检测。

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型液相色谱仪,配二元输液泵、自动进样器、柱温箱和脱气机;API 4000型三重四极杆质谱仪;5810R 型低温离心机;Vortex-genie 2型旋涡混合器;BSA2245S-CW 型电子天平;Milli-Q型超纯水系统;针筒式过滤器,配0.22μm 有机相滤膜;PRi ME HLB 通过式固相萃取柱(1 mL/30 mg)。

混合内标溶液:环孢素A-d4和他克莫司-13C,d2质量浓度分别为5,0.5 mg·L－1,介质为甲醇。

混合标准储备溶液:环孢素A 和他克莫司的质量浓度分别为200.0,10.0 mg·L－1,介质为甲醇。

混合标准溶液系列:分别取5,25,100,250,500,1 000μL 混合标准储备溶液于6个10 mL 容量瓶中,用甲醇稀释,得到环孢素A 的质量浓度分别为0.1,0.5,2.0,5.0,10.0,20 mg·L－1,他克莫司的质量浓度分别为5,25,100,250,500,1 000μg·L－1的混合标准溶液系列。

基质匹配混合标准溶液系列:取180μL人空白全血至1.5 mL离心管中,加入20μL混合标准溶液系列,得到环孢素A 的质量浓度分别为10,50,200,500,1 000,2 000μg·L－1,他克莫司的质量浓度分别为0.5,2.5,10,25,50,100μg·L－1的基质匹配混合标准溶液系列。

质控溶液:分别取40,200,800μL 的混合标准储备溶液于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到低、中、高浓度水平的质控溶液,其中环孢素A的质量浓度为0.8,4.0,16 mg·L－1,他克莫司的质量浓度为40,200,800μg·L－1。

环孢素A、他克莫司、环孢素A-d4和他克莫司-13C,d2标准品的纯度均大于99.0%(规格均为0.1g);甲醇、乙腈均为色谱纯;甲酸和乙酸铵的纯度均大于98.0%;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm);柱温60 ℃;进样量10μL;流量1.0 mL·min－1;流动相A 为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的0.01 mol·L－1乙酸铵溶液,B为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序:0～0.50 min,A 由35%降 至5%,保 持3.50 min;4.00～4.01 min,A 由5%跳转至35%,保持2.99 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI＋)扫描模式,电压5 500 V;离子源温度400 ℃;气帘气压力137.9 kPa,辅助加热气压力344.7 kPa,碰撞气压力41.4 k Pa;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1,其中“∗”代表定量离子对。

1.3 试验方法

取200μL人全血样品,置于1.5 mL离心管内,加入20μL混合内标溶液,混匀。加入300 mmol·L－1硫酸锌溶液200μL,涡旋60 s,加入600μL 乙腈,涡旋120 s,静置5 min,待蛋白沉淀完全,以12 000 r·min－1转速离心10 min。分取上清液约1 mL,注入PRi ME HLB通过式固相萃取柱。收集流出液,按照仪器工作条件测定。

2.1 质谱条件的选择

离子源温度对环孢素A 的电离效果影响显著,离子源温度过高时,环孢素A 的质谱响应值明显降低,因此试验考察了离子源温度分别为350,400,450,500℃时对环孢素A 和他克莫司质谱响应值的影响,结果见图1。

由图1 可知,和其他温度相比,离子源温度为400 ℃时环孢素A 和他克莫司响应值均较高,因此试验选择的离子源温度为400 ℃。

试验比较了ESI＋和电喷雾离子源负离子(ESI－)扫描模式下2种目标物的响应值。结果显示,ESI＋扫描模式下环孢素A 及他克莫司响应值和稳定性均较高,这是由于环孢素A 及他克莫司分子结构中均有含氮基团,易在ESI＋模式下电离得到母离子[M＋H]＋、[M＋NH4]＋。以[M＋NH4]＋为前体离子,继续在ESI＋模式下进行m/z200～1 250以内的产物离子扫描,优化去簇电压和碰撞能量,选择稳定性强、响应值高的2个碎片离子对分别作为定量、定性离子对,所得质谱参数见表1。

2.2 色谱条件的选择

试验比较了ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,3.5μm)、Eclipse Plus-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm)、Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm)对环孢素A 和他克莫司的分离效果,结果见图2。

图2 环孢素A 和他克莫司在不同色谱柱上的色谱图Fig.2 Chromatograms of cyclosporine A and tacrolimus on different columns

由图2可知,环孢素A 和他克莫司在Infinity-Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm)上色谱峰展宽现象不明显,色谱峰峰形尖锐、对称。因此,试验选择以Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm)进行色谱分离。

乙腈和甲醇是液相色谱常用的有机相,通过对比发现,使用乙腈作为有机相时,环孢素A 和他克莫司均能获得更高的响应值和更好的峰形,且有机相和提取溶剂一致,避免了溶剂效应。因此,试验选择采用乙腈配制有机相。流动相的酸度会影响目标物的存在形式,进而影响色谱分离和质谱电离的效果,而酸可以促进ESI＋模式下目标物的电离,经过系列试验,最终选择在水相和有机相中添加的酸为甲酸,甲酸的体积分数为0.1%。

2.3 特异性试验

按照试验方法分析空白样品和空白加标样品,结果见图3。

由图3可知,目标物峰形良好、基线平稳、干扰较小,方法的特异性良好。

图3 空白样品和空白加标样品的色谱图Fig.3 Chromatograms of the blank sample and the blank spiked sample

2.4 基质效应

分别在2份10μL中浓度水平的质控溶液中加入500μL乙腈和500μL 空白人全血样品溶液,按照试验方法测定,以后者与前者峰面积的比值计算基质效应(ME)值。结果显示,环孢素A 和他克莫司的ME值分别为87.90%,110.5%,说明存在一定的ME。因此,试验选择采用基质匹配法和内标法进行定量。

2.5 工作曲线、检出限和测定下限

按照试验方法分析基质匹配混合标准溶液系列,以环孢素A 和他克莫司的质量浓度为横坐标,峰面积和对应的内标峰面积比值为纵坐标绘制工作曲线。结果显示,环孢素A 和他克莫司工作曲线的线性范围分别为10～2 000 μg·L－1和0.5～100μg·L－1,线性回归方程分别为y＝4.250×10－5x＋3.580×10－5和y＝4.960×10－3x＋7.350×10－4,相关系数分别为0.999 7和0.999 6。

以空白加标的方法进行试验,以不小于3,10倍信噪比对应的加标量作为环孢素A 和他克莫司的检出限和测定下限,检出限分别为1.24,0.05μg·L－1,测定下限分别为3.19,0.18μg·L－1。

2.6 精密度和回收试验

在3份180μL空白人全血样品中分别加入低、中、高等3个浓度水平的质控溶液各20μL,按照试验方法测定,每个浓度水平每天重复测定5次,连续测定5 d,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

由表2可知,环孢素A 和他克莫司的回收率分别为92.2%～106%和94.1%～108%,日内RSD 分别为2.9%～7.8%和4.7%～7.6%,日间RSD 分别为4.5%～6.7%和5.1%～8.2%。

表2 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.7 方法对比

分别采用本法和HPLC[7]分析空白加标样品(环孢素A 和他克莫司的加标量分别为1 000,50μg·L－1)。结果显示,两种方法测定值相对偏差的绝对值为3.0%～6.6%,说明方法的一致性较好,但本法采用的固相萃取柱为通过式固相萃取柱,省去了活化、洗脱等步骤,操作更简单;除此之外,HPLC中共提取物容易污染色谱及质谱系统,给定量分析带来干扰,而本法基线平稳、干扰较小,且使用基质匹配法和内标法定量,测定值更加准确、可靠。

2.8 质控试验

为避免出现假阳性或假阴性结果,在实际样品分析时必须插入质控样,以确保测定结果准确、可靠。以未服用相关药物的健康人全血为空白样品,分取2份空白样品各180μL,在其中1份中加入中浓度水平的质控溶液20 μL,另1 份加入甲醇20μL,按照试验方法制备空白加标样品溶液和空白样品溶液,并在每分析20个实际样品时依次插入一个空白样品溶液和空白加标样品溶液。结果显示,在分析20个实际样品后,空白样品溶液中目标物的测定值均低于检出限,空白加标样品溶液中目标物的回收率均在90.0%～110%内。

2.9 样品分析

按照试验方法分析10份实际样品,结果显示,环孢素A 和他克莫司的检出量分别为100.6～135.0μg·L－1和8.5～13.8μg·L－1。

本工作以通过式固相萃取柱净化人全血样品,以HPLC-MS/MS测定其中环孢素A 和他克莫司的含量,方法的分离效果较好、灵敏度高、准确度以及精密度好,可满足血液中痕量残留物的分析要求,可用于人实际血液样品的检测。

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