MSMEG_6171在耻垢分枝杆菌中的表达及多组学关联分析

谭秋婵，魏文静，陈珣珣，张晨晨，赵雨川，巫株华

结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的慢性传染病。在新型冠状病毒出现之前，结核病是单一感染源导致死亡的主要原因[1]。根据世卫组织最新统计，2020年约有150万人死于结核病[2]。随着耐药菌株的出现，结核病的治疗面临严峻的挑战，因此，研究调控结核分枝杆菌生长过程的关键基因和信号传导网络将有助于揭示其生长调节机制, 同时为深入研究基因的调控机制以及筛选新的细胞壁作用药物靶点提供重要的理论依据。

结核分枝杆菌的细胞壁主要由糖类和脂质组成，是分枝杆菌抵御外界环境压力及逃逸宿主免疫攻击的重要屏障[3]。相关组分的生物合成过程、转运过程以及代谢或信号调控通路等是寻找新的药物靶点的潜在对象[4]。耻垢分枝杆菌(Mycolicibacteriumsmegmatis, Msm)作为一种模式生物，在研究分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌的致病性、毒力、潜伏和耐药等分子机制方面有着其独特的优势[5]。MSMEG_6171是耻垢分枝杆菌中一个功能未知的蛋白，是结核分枝杆菌Rv3660c同源蛋白，具有61%的同源性。2011年England K的一项研究表明Rv3660c过表达时可抑制隔膜生成而引起菌体纤丝化，该研究通过转录组学分析，发现过表达该蛋白可以引起一些休眠调节子和在适应性代谢中发挥作用的sigma因子的mRNA表达量发生显著变化[6]。过表达MSMEG_6171可以改变耻垢分枝杆菌的脂质代谢，从而改变耻垢分枝杆菌胞膜的结构并增强耻垢分枝杆菌对抗生素的耐药性[7]，但是并未对其调控网络和候选关键基因进行深入筛选、分析和验证。因此，本实验构建了重组耻垢分枝杆菌Msm::6171，通过蛋白质组数据及转录组数据的对比分析, 深入挖掘了MSMEG_6171调控耻垢分枝杆菌生长过程中下游信号网络, 找到了一批受MSMEG_6171特异调控的已知和未知功能的基因并进行了初步验证, 为深入研究MSMEG_6171的调控网络提供了新的认识和重要参考。

1.1 实验材料 质粒pMV261、E.coilTop10和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsegmatismc2155, Msm) 由本实验室保存。T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶(NEB)，胶回收试剂盒、质粒提取试剂(Omega)，反转录试剂盒、荧光定量 PCR试剂盒(诺维赞)，PCR引物由广州天一辉远公司合成，prestained protein ladder(Fermentas)，卡那霉素(Axygen)。

1.2 方 法

1.2.1 重组耻垢分枝杆菌的构建 利用引物设计软件Premier 5.0，根据NCBI GenBank (基因序列号NC_008596.1)中耻垢分枝杆菌MSMEG_6171基因序列设计引物，以耻垢分枝杆菌的基因组为模板，扩增MSMEG_6171基因，引物序列见表1。PCR纯化产物和质粒pMV261进行EcoR I和Hind III双酶切，将回收纯化的双酶切产物用T4连接酶进行连接后转化至E.coliTop10感受态细胞中，均匀涂布于LB固体培养基(30 μg/mL 卡那霉素)，挑取单菌落培养并进行菌落PCR检测阳性克隆并测序验证。将构建成功的pMV261-MSMEG_6171重组质粒电转(电压2.5 kV，电阻1 000 Ω，电容25 μf)进入耻垢分枝杆菌感受态中，以空载质粒作对照。均匀涂布于含30 μg/mL卡那霉素的7H10固体平板上，培养2～3 d，菌落PCR检测阳性克隆。

1.2.2 总RNA的提取和RNA-seqMsm::6171和WT菌株培养至对数生长期，Fastprep 24裂解菌体，用Trizol法提取总RNA，通过Nanodrop检测RNA纯度，6% Urea PAGE鉴定总RNA完整性。将RNA样本保存于干冰中，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组学测序和生物信息学分析。通过 Illumina 二代高通量测序平台进行测序，每组 3 个生物学重复。

1.2.3 real-time RT-PCR 在NCBI GenBank 中查找基因序列，通过NCBI Primer-BLAST在线软件设计实时定量引物，PCR的引物序列见附表1。cDNA合成采用HiScript○RIII RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录试剂盒。以cDNA为模板扩增目的基因片段。使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应，qPCR反应采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒，扩增体系和扩增条件参照试剂盒说明书。根据反应得到的 CT 值，经2-△△CT方法计算基因表达变化。

1.2.4 基于iTRAQ的蛋白质组学鉴定和定量分析 灭活的耻垢分枝杆菌用Fastprep-24TM裂解细菌(频率6.5，时间30 s，裂解2次)，离心取上清，用0.22 μm过滤器过滤上清即为菌体蛋白样品，冻存于-80 ℃备用。SDS-PAGE 检测总蛋白提取质量，采用BCA蛋白质定量试剂盒(Merck)进行定量。每个样品取 100 μg 蛋白，补齐至相同体积后加入3.3 μg 胰蛋白酶消化24 h。按照试剂盒的操作步骤对得到的肽段溶液进行iTRAQ 6-plex kits标记，对照组分别标记为iTRAQ reagent 114、115、116的iTRAQ同位素标签。Msm::6171过表达组分别标记为117、118、121的iTRAQ同位素标签，室温反应2 h。将标记后的样品混合，真空冷冻离心干燥。将干燥后的混合样品采用反相高 pH液相的方法进行脱盐和分级处理，真空干燥后，通过Dionex Ultimate3000高效液相系统进行梯度洗脱分离。使用Thermo Q-Exactiver对样品进行质谱检测。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 生物信息学分析 RNA-seq的下机数据进行数据过滤后，采用Bowtie2 比对软件进行分析。根据readcount数据来进行基因差异表达分析，对显著差异表达基因筛选的阈值设置为|log2(FoldChange)| > 1 且qvalue < 0.05。运用 ProteinPilot 4.5对蛋白进行定量分析和差异蛋白质的筛选，设置蛋白可信度在95%以上，/CV/≥0.5去除重复性不好的蛋白，在P≤0.05基础上选取fold change≥2为上调蛋白，fold change≤0.50为下调蛋白。通过转录组学和蛋白组学数据进行比对，进行一直表达的下调和上调基因的筛选。使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行Gene Ontology和KEGG富集分析[8]。以person相关系数为评价指标计算基因mRNA水平和蛋白质水平表达的遗传相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 构建MSMEG_6171 基因过表达菌株 以耻垢分枝杆菌mc2155的基因组DNA为模板，扩增得到968 bp特异性PCR产物，与预期的MSMEG_6171片段大小一致(图1A)。进一步成功构建pMV261-MSMEG_6171 表达载体，并挑取重组载体转化后的单克隆进行菌液PCR验证(图1B)。pMV261-MSMEG_6171 电转化耻垢分枝杆菌后，提取野生型耻垢分枝杆菌(WT)和过表达MSMEG_6171 的耻垢分枝杆菌(Msm::6171)总RNA进行qRT-PCR验证，结果显示，与WT相比，Msm::6171菌株中MSMEG_6171的表达水平显著提高(图1C)。

注：A为MSMEG_6171全长的PCR扩增产物；
B为MSMEG_6171过表达耻垢分枝杆菌菌液PCR验证，1,2,3泳道均为验证阳性的菌株；
C为Msm::6171和WT菌株中MSMEG_6171基因 real-time RT-PCR表达分析。图1 成功构建了MSMEG_6171 基因过表达菌株Msm::6171Fig.1 Construction of MSMEG_6171 overexpressionstrain (Msm::6171)

2.2 转录组与蛋白质组的比较分析 为了深入揭示MSMEG_6171在耻垢分枝杆菌生长过程中的调控网络，我们收取了WT和Msm::6171菌株进行了转录组分析。结果显示(图2A)，与野生型相比,Msm::6171菌株有819个基因的表达水平显著上调, 775个基因的表达水平显著下调。对照蛋白质组学的结果，与野生型相比,Msm::6171菌株有286个蛋白的表达水平显著上调, 222个蛋白的表达水平出现显著下调(图2B)。两组学联合分析发现有38个基因在转录水平和蛋白表达水平都显著上调, 有31个基因都显著下调(图2C)。Person相关系数分析结果显示，筛选的差异表达基因在转录本和蛋白质水平呈正相关(r=0.857，P<0.05)(图2D)。

注：A为DESs火山图；
B为DEPs火山图；
C为DEGs和DEPs的Venn图，筛选获得表达趋势一致的基因，蓝色圈和红色圈分别代表DEGs和DEPs；
D为pearson相关性分析。图2 Msm::6171菌株转录组和蛋白组学分析Fig.2 Transcriptomic and proteomic analysis of the Msm::6171strain

对这些表达趋势一致的基因进行GO和KEGG分析，结果显示，转录本和蛋白质水平均上调的38个基因, 生物过程(biological process, BP)主要富集在甘油分解过程和3磷酸甘油代谢过程和CO2固定过程，分子功能(molecular function, MF)主要富集在ATP结合和酶活性；
通过KEGG分析(FDR<0.05)，显著富集的通路主要有代谢通路、不同环境下的微生物代谢以及甘油酯代谢等(图3)。转录本和蛋白质水平均下调的31个基因，生物过程主要富集在翻译过程，分子功能显著富集在核糖体的结构组成部分以及核糖体RNA 结合，细胞组分(cellular component, CC)显著富集在核糖体和核糖体亚基；
KEGG通路富集分析发现下调的差异表达基因集中于核糖体和代谢通路。

注：A为GO富集分析(BP：生物过程；
MF：分子功能；
CC：细胞组分)；
B为KEGG通路富集分析。图3 表达趋势一致基因的GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of genes with consistent expression

2.3 差异表达基因的qRT-PCR验证 38个显著上调基因中，选取显著富集到KEGG通路上的基因(10个)为候选基因，31个显著下调基因中有16个为核糖体蛋白编码基因，从中选取5个表达差异倍数大的基因作为候选基因，用qRT-PCR对选取的15个候选基因进行实时荧光定量 PCR 的验证，结果显示，通过 qRT-PCR 测定的基因表达趋势与转录组和蛋白质组测序结果保持一致(图4)。

图4 差异表达基因的qRT-PCR验证Fig.4 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

基于生物信息学分析发现，MSMEG_6171的同源蛋白Rv3660c在细胞形态和适应性代谢中发挥着重要作用。在我们之前的研究中从代谢组学和脂质组学的角度报道了MSMEG_6171过表达可以通过诱导甘油酯和磷脂的改变来调节脂质的合成和代谢，从而改变分枝杆菌胞膜的结构和功能，并增强对抗生素的耐药性。本实验利用构建的MSMEG_6171过表达的耻垢分枝杆菌，通过转录组和蛋白质组数据的对比分析, 深入挖掘了MSMEG_6171的下游信号网络, 并筛选了一批受MSMEG_6171特异调控的关键靶向基因并进行验证，为深入研究MSMGE_6171的调控网络和相互作用蛋白提供了新的认识和重要参考。

近年来, 多组学联合分析已逐渐成为生命科学研究的新热点，通过转录组学和蛋白质组学技术联合分析, 可以深入理解基因和蛋白质之间的内在联系[9-10]。本研究利用转录组和蛋白质组关联分析, 挖掘MSMEG_6171可能调控的相关候选基因, 发现关联到69个差异基因显著差异表达，其中上调表达38个，下调表达31个, 通路富集分析发现上调基因主要集中在代谢通路、不同环境下的微生物代谢，甘油酯代谢以及脂肪酸合成与代谢等，生物过程主要富集在甘油分解过程和3磷酸甘油代谢。参与代谢过程的MSMEG_4757，MSMEG_4329，glpK，hybA，hybC，MSMEG_0685，MSMEG_1986，MSMEG_3464，MSMEG_4263的表达量在MSMEG_6171过表达时表现出上调，这些基因可能作为研究耻垢分枝杆菌代谢分子机制的关键候选基因。其中MSMEG_4757(脂肪酸合成酶)和MSMEG_4329(丙酰辅酶A羧化酶)参与脂肪酸生物合成与代谢途径；
glpK是一种甘油激酶，研究显示甘油激酶在分枝杆菌的生长和新陈代谢过程中发挥重要的作用[11]。在下调的基因中，16个核糖体蛋白基因，且主要富集在发挥核糖体的装配以及核糖体RNA 结合。核糖体蛋白除了在细胞内蛋白质生物合成中发挥着重要作用外，还具有其他的生物学功能。2015年，有研究人员发现一种抗生素先导物，它可调控通过核糖开关抑制细菌生长[12]。最新的一篇综述报道显示，在不利环境的诱导下，细菌核糖体下调其活性，并表现出翻译不活跃[13]，而本研究中，下调基因的生物过程主要富集在翻译过程。我们之前研究结果显示MSMEG_6171过表达导致耻垢分枝杆菌生长缓慢，引起这一变化的原因可能是随着生长的进行，菌体内活性氧水平逐渐升高，但菌体中的氧化应激引起了内质网应激反应，在核糖体蛋白基因的表达上表现出效应，因而使得在表达的核糖体蛋白基因减少[14]。

基于以上的分析结果, 我们推测在MSMEG_6171过表达后，一方面会影响核糖体蛋白基因的表达导致耻垢分枝杆菌生长缓慢; 另一方面在代谢过程中, 与脂类物质的合成和代谢相关的MSMEG_4757，MSMEG_4329，glpK等成员, 它们的蛋白表达水平也很可能受到MSMEG_6171的调控, 同时还可能激活包括MSMEG_1986在内的乙醛酸和二羧酸代谢的表达，这些蛋白很可能就是受到MSMEG_6171的正向调控。除了这些已知功能的基因, 我们还挖掘了一些受MSMEG_6171调控的蛋白, 比如MSMEG_1244、MSMEG_1246、MSMEG_1887、MSMEG_2267、MSMEG_2268等, 为后续选择候选基因深入研究各层次的修饰及功能调控提供了参考。

利益冲突：无

引用本文格式：谭秋婵，魏文静，陈珣珣，等. MSMEG_6171在耻垢分枝杆菌中的表达及多组学关联分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：982-987. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.141

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