样本分析前质量控制对新型冠状病毒核酸检测结果的影响

李艳 郭心灵 马晓霞 靳福旭

作者单位：300308 天津，天津医科大学总医院空港医院检验科

2019 年12 月以来，由新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）引起的新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）疫情在全球各地持续发生。2020 年1 月12日国际病毒分类委员会将该病毒命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］。有研究表明，2019-nCoV 在塑料和钢表面可存活3 d［2-3］，收治新冠肺炎患者的医院环境采样存在2019-nCoV 污染，表明病毒可以通过物体表面间接传播［4］。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的建议，及时准确地检出鼻咽拭子样本中2019-nCoV的RNA，是直接诊断新冠肺炎的首选方法，血清学检测可作为疾病诊断以及流行病学研究的补充方法［5-8］。检测出无症状感染者体内的2019-nCoV，并追踪他们的所有潜在的接触者，被认为是限制病毒进一步传播的关键［9］。2019-nCoV 的传播可能发生在窗口期，潜伏期内也可能传播，在任何临床症状出现前的一到两周甚至更长时间段内均有可能传播［9-10］。因此，无症状感染者和近期发病者的鉴定必须是基于病毒RNA 的直接鉴定［7-8］。然而，在新冠肺炎大流行和2019-nCoV 高突变的背景下，以及考虑到病毒核酸检测试剂的潜在局限性，不能满足及时检测样本中病毒RNA 的要求。在2019-nCoV核酸检测过程中，由于RNA 降解导致的假阴性结果都可能影响临床医师对疾病的诊断。

对临床实验室来说，标准化的样本运输方式、样本储存时间和温度要求是至关重要的，也是实验室分析前质量控制（质控）的重要组成部分。本研究收集10例新冠肺炎住院患者的20份鼻咽拭子样本，将每份鼻咽拭子样本进行21 等分，其中1 份于当日进行检测，另外于室温（25 ℃）、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃条件下分别存放5 等份样本，并于存放的第1、2、3、7、14 天进行2019-nCoV 核酸提取与扩增，比较循环阈值（cycle threshold，CT 值），探讨样本保存时间和温度对核酸检测结果的影响，现报告如下。

1.1 样本采集 采集10 例新冠肺炎住院患者（由于医院性质原因，非同一时期住院患者）鼻咽拭子，将样本置于（4.0±0.3）mL 运送培养基内。采用实验当日本院职工筛查标本（＞40 份/d）作为阴性对照，同时采用3 份生物安全柜内紫外线照射过的生理盐水参与提取和扩增的全过程。弱阳性质控采用第三方质控品参与提取和扩增全过程。

1.2 仪器与试剂 使用含有胍盐成分的灭活样本保存液（购自天津灏洋华科生物科技有限公司）保存拭子，2019-nCoV RNA 液体室内质控品S0 购自广州邦德盛生物科技有限公司，浓度为9.86×102个拷贝/mL，采用NSE-32 核酸提纯仪（购自西安天隆科技有限公司）进行样本核酸提取，扩增使用的实时荧光聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）2019-nCoV 核酸检测试剂盒购自广州达安基因股份有限公司，ABI 7500 扩增仪购自赛默飞世尔科技（中国）公司，实验所用耗材均为无酶耗材。

1.3 检测方法 采集每位患者的两份鼻咽拭子，分别混匀、静置，在标本采集后3 h 内进行20 等分。在标本分装完成之前，所有标本除加样、分装外，均置于4 ℃保存待用。当日检测标本从采样到上机扩增时间控制在2 h 内，并以此CT 值作为参考。剩余标本分为4 组：25 ℃（室温）、4 ℃（冰箱）、-20 ℃（冷冻）、-80 ℃（低温冷冻），每个温度5 份；
在第1、2、3、7、14 天后进行核酸提取和扩增，并记录CT 值，与参考CT 值进行比较。

使用自动化核酸提取平台NSE-32 核酸提纯仪提取RNA，使用ABI 7500 扩增仪进行qRT-PCR 反应，每次实验都由一个外部阳性质控品（广州邦德盛生物科技有限公司）和3 个阴性来料质控（incoming quality control，IQC）监控，以当日本院职工筛查标本作为对照，上述质控始终与患者样本平行运行。

1.4 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并经本院伦理审批（审批号：IRB2022-WZ-02），所有检测均获得过患者或家属的知情同意。

1.5 统计学分析 根据变量分布，使用Wilcoxon 符号秩和检验对当日检测CT 值和剩余等分标本的检测CT 值进行比较。多次重复的方差分析用于评估温度和时间对标本检测的影响。P＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2.1 相同保存温度不同保存时间2019-nCoV 核酸检测结果 样本在-20 ℃和-80 ℃储存7 d、4 ℃保存48 h 后相对稳定；
样本在-20 ℃和-80 ℃储存7 d、4 ℃储存48 h和室温储存24 h后核酸检测CT值有明显的上升趋势。见图1～2。

图1 相同保存温度不同保存时间样本2019-nCoV核酸检测N 基因CT 值比较

2.2 不同样本在不同变量下2019-nCoV 核酸检测CT 值的CV 值比较 对20 份样本在不同变量下的2019-nCoV 核酸检测结果CT 值的CV 值进行统计分析，在忽略保存时间的条件下，样本保存在25 ℃（室温）下保存时，ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 偏大；
样本保存在-80 ℃条件下，样本的ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 偏小。在不同温度下，ORF-1ab基因在保存第7 天时CV 均＞5%；
N 基因在保存第7 天时25 ℃、4 ℃和-20 ℃出现CV 值＞5%。见表1。在忽略保存温度的条件下，样本保存时间为7 d 时标本的ORF-1ab 基因和N 基因CT 值的CV 偏大，样本保存时间为14 d 时，20 份标本中有6 份标本ORF-1ab 基因CT 值的CV＞5%，7 份标本N 基因CT值的CV＞5%。见表2。

表2 保存不同时间2019-nCoV 核酸检测ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 值

图2 相同保存温度不同保存时间样本2019-nCoV核酸检测ORF-1ab 基因CT 值比较

表1 不同保存温度下2019-nCoV 核酸ORF-1ab和N 基因CT 值的CV 值

本研究表明，在分析2019-nCoV 核酸两个靶基因的CT 值时，鼻咽拭子样本的储存温度及储存时间等条件可被视为2019-nCoV 核酸检测分析中潜在的分析前误差因素。

有研究表明，在现有的出院标准下，仍有部分患者是2019-nCoV 携带者，目前疫情已进入常态化阶段，及时进行重点人群核酸检测和随访，对预防疫情反弹至关重要［11］。在疫情常态化防控阶段，核酸检测结果的准确性至关重要，而检验前的标本质控是保证检测结果准确性的重要一环。对疑似新冠肺炎患者的鼻咽拭子进行RT-PCR 可以准确诊断新冠肺炎［10，12］。RT-PCR 基于指数扩增动力学，CT 值与样本中的病毒载量密切相关［12］。RT-PCR 结果还与以下因素相关：① 样本采集质量；
② 样本采集到检测的时间；
③ 样本保存以及运输温度；
④ 样本保存缓冲液；
⑤ 提取核酸过程（包括提取试剂、仪器、加样量以及人员操作）；
⑥ RT-PCR 扩增试剂的前期处理、RNA 加样、扩增过程以及不同人员对结果的解释等。在以上因素中，任何步骤产生误差都有可能影响检测结果，从而影响临床诊断。为降低标本采集误差对研究结果的影响，本研究选择同一患者的鼻咽拭子两份标本充分混匀再进行等分，尽量减少变量以外的因素对检测结果的影响。从采集样本到将样本运送到实验室进行检测可能需要较长的时间间隔，特别是病毒大面积隐匿传播，需要进行重点人群核酸筛查时。在上述情况下，要控制样本的运输温度与运送时间，将对核酸检测结果的影响降到最小。本研究结果表明，样本在-20 ℃和-80 ℃条件储存的前7 d 内和在4 ℃条件保存的48 h 内相对稳定；
样本在-20 ℃和-80 ℃条件储存7 d、4 ℃条件储存48 h 和室温储存24 h 后核酸检测CT 值结果有明显的上升趋势。

本研究的局限性主要在于仅使用一种类型的采样拭子、一种提取试剂和一种扩增试剂，缺乏不同试剂间的比较，这可能对样本的完整性和测试结果产生一定的影响。

综上所述，样本储存温度和时间是2019-nCoV核酸检测中潜在的分析前误差，由于RNA 的不稳定性，当检测延迟时，尤其是在处于较高的储存温度，经过较长的储存时间，且病毒载量较低的情况下，由于样本的保存温度和保存时间不恰当可能会造成假阴性结果，从而影响临床诊断。样本采集后应在低温保存运输并尽快检测，以减少因储存温度和时间导致的分析前误差。本研究数据可能会为制定新冠肺炎分子诊断的标准操作规程提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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