临床血液和尿液样本分离肠球菌毒力基因分析

康 怡， 朱 宏， 沈 瀚， 周万青

（1.南京医科大学鼓楼临床医学院，江苏 南京 210008；
2.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，江苏 南京 210008）

肠球菌是人体胃肠道内自然定植的条件致病菌，在机体免疫功能受损和菌群移位时可引起泌尿道感染、血流感染、心内膜炎、腹膜炎等，是临床感染病原菌中仅次于金黄色葡萄球菌的革兰阳性球菌[1]。我国耐药监测数据显示，临床分离肠球菌以屎肠球菌（48.0%）和粪肠球菌（44.8%）为主[1]；
样本来源以尿液样本最多，其次为血液样本，尿液样本分离肠球菌以粪肠球菌为主，血液样本中屎肠球菌更为常见[2]。虽然肠球菌感染的发病机制尚不明确，但有研究发现，全身性感染与移动遗传元件编码的某些毒力因子和抗菌药物耐药性具有一定的相关性[3]。毒力基因能帮助肠球菌突破宿主的免疫防御系统，造成定植，甚至侵入细胞，导致感染的发生和发展[1]。本研究旨在探讨临床血液样本和尿液样本中分离的肠球菌中6种毒力基因（cylA、agg、asa1、gelE、esp和hyl）的携带情况，为深入研究肠球菌毒力基因与致病性间的关系提供参考。

1.1 菌株来源

收集2017—2019年南京医科大学鼓楼临床医学院临床送检中段尿样本和血液样本中分离的非重复肠球菌株196株，其中中段尿样本来源106株（粪肠球菌49株、屎肠球菌57株）、血液样本来源90株（粪肠球菌44株、屎肠球菌46株）。采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪（法国生物梅里埃公司）进行菌种鉴定，并经VITEK MS微生物质谱鉴定系统（法国生物梅里埃公司）复核。质控菌株粪肠球菌（ATCC 29212）为医院微生物室留存菌株。

1.2 主要仪器和试剂

PCR扩增仪（美国ABI公司）；
2×Taq Mix和4S GelRed核酸染料（上海BBI公司）；
100 bp DNA Marker（日本TaKaRa公司）；
蛋白酶K（美国Merck公司）；
琼脂糖干粉（法国Biowest公司）；
164-5070通用凝胶电泳仪和GelDoc XR型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rod公司）。

1.3 毒力基因扩增

采用加热煮沸法提取细菌DNA，挑取纯培养菌落，置于含200 ng/mL蛋白酶K溶液的1.5 mL离心管内，56 ℃水浴2 h后，再95 ℃水浴10 min，13 000×g离心30 s，取上清液为模板。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增毒力基因cylA、esp、asa1、hyl、gelE和agg，参照文献[4-5]合成引物。cylA、esp、asa1、hyl和gelE采取多重扩增方法，反应体系为50 μL，包括2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，cylA、esp、asa1、hyl和gelE的上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dd H2O 13 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 1 min，56 ℃1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃ 7 min。agg的反应体系为20 μL，包括2×Taq Mix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dd H2O 6 μL。PCR反应条件：94 ℃5 min；
94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃ 7 min。PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳，GelRed染色后观察结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 粪肠球菌和屎肠球菌毒力基因携带情况

93株粪肠球菌携带asa1（76.3%）、gelE（71.0%）、cylA（64.5%）、esp（60.2%）和agg（22.6%）基因，未检出hyl基因。103株屎肠球菌携带esp（68.9%）和hyl（31.1%）基因，未检出cylA、asa1、gelE和agg基因。

2.2 不同样本来源粪肠球菌毒力基因携带情况

血液样本分离粪肠球菌以gelE基因检出率（75.0%）最高；
有13株仅携带gelE基因（10/13）；
8株携带2种毒力基因，最常见组合是asa1-gelE（4/8）；
21株携带多种（>2种）毒力基因，最常见的组合是cylA-esp-asa1-gelE-agg（8株）；
2株6种毒力基因均未检出。尿液样本分离粪肠球菌以asa1基因检出率（85.7%）最高；
有4株仅携带gelE基因；
5株携带2种毒力基因，常见的组合是esp-gelE（2株）和cylA-asa1（2株）；
39株携带多种（>2种）毒力基因，最常见的组合是cylA-esp-asa1-gelE（16株）；
1株6种毒力基因均未检出。尿液样本分离粪肠球菌cylA和asa1毒力基因检出率高于血液样本（P<0.05）。粪肠球菌毒力基因主要以组合形式存在。见图1、表1、表2。

表1 不同样本来源粪肠球菌毒力基因检出情况 株（%）

表2 不同样本来源粪肠球菌毒力基因检出模式 株

图1 肠球菌部分毒力基因PCR产物电泳图

2.3 不同样本来源屎肠球菌毒力基因携带情况

血液样本分离的屎肠球菌仅检出h y l（34.8%）和esp（58.7%）2种毒力基因；
有18株仅携带esp基因，7株仅携带hyl基因，9株同时携带hyl和esp基因，12株未检出毒力基因。尿液样本分离的屎肠球菌也仅检出hyl（28.1%）和esp（77.2%）2种毒力基因；
有33株仅携带esp基因，5株仅携带hyl基因，11株同时携带hyl和esp基因，8株未检出毒力基因。尿液样本分离屎肠球菌esp毒力基因检出率高于血液样本（P<0.05）。屎肠球菌毒力基因主要以单基因形式存在。103株屎肠球菌中，仅20株同时检出2种基因。见表3、表4。

表3 不同样本来源屎肠球菌毒力基因检出情况 株（%）

表4 不同样本来源屎肠球菌毒力基因携带模式 株

2.4 相同样本来源不同菌种毒力基因携带情况

血液样本分离株中，粪肠球菌cylA、asa1、gelE和agg毒力基因的携带率高于屎肠球菌（χ2值分别为25.2、44.7、54.5、13.1，P<0.05）；
屎肠球菌hyl毒力基因的携带率高于粪肠球菌（χ2=18.6，P<0.05），esp基因携带率差异无统计学意义（P>0.05）。尿液样本分离株中，粪肠球菌cylA、asa1、gelE和agg毒力基因的携带率高于屎肠球菌（χ2值分别为77.8、80.9、55.7、12.8，P<0.05）；
屎肠球菌hyl毒力基因的携带率高于粪肠球菌（χ2=16.2，P<0.05），esp基因携带率差异无统计学意义（P>0.05）。

本研究结果显示，尿液样本和血液样本中，粪肠球菌均主要携带cylA、esp、asal、gelE和agg 5种毒力基因，而屎肠球菌均仅携带esp和hyl 2种毒力基因；
粪肠球菌携带的毒力基因种类和各基因检出率均高于屎肠球菌，提示粪肠球菌的毒力更强，与相关研究结果[6]一致。有研究结果显示，万古霉素耐药屎肠球菌较万古霉素敏感屎肠球菌携带的毒力基因种类更多[7]，会给临床抗感染治疗带来更大的困难。esp基因编码表面蛋白，可促进细菌进入细胞。有研究发现，临床感染患者分离株esp基因的检出率远高于健康人肠道来源菌株[3]。提示esp基因与肠球菌临床感染密切相关。本研究结果显示，esp基因在粪肠球菌和屎肠球菌中均有检出，且该基因在不同菌种间的表达差异无统计学意义（P>0.05），提示esp基因可能是肠球菌感染机体的重要条件之一。hyl基因作为屎肠球菌特有的毒力基因[8-9]，基因序列与酿脓链球菌透明质酸酶基因高度同源[3]，所表达的蛋白可促进细菌在组织细胞中的扩散，进而促进细菌侵袭的发生。有研究发现，用含有hyl质粒的屎肠球菌转染小鼠腹膜炎模型，可使其定植率更高，毒力和耐药性更强[10-11]。

王彦杰等[12]发现，不同样本分离粪肠球菌或屎肠球菌在毒力基因的携带种类上具有一致性，但尿液样本分离菌株部分毒力基因携带率高于血液样本分离菌株：尿液样本分离粪肠球菌cylA和asa1携带率高于血液样本（P<0.05），屎肠球菌esp携带率高于血液样本（P<0.05），与本研究结果相似。提示致尿路感染的肠球菌携带多种毒力基因。不同样本来源菌株毒力基因表达差异的可能原因有：（1）与患者状态有关，肠球菌血流感染好发于免疫功能严重受损的患者，此类患者常合并恶性肿瘤、心血管疾病、胃肠道疾病等[13]，病死率高；
肠球菌尿路感染多发生于尿路结构异常和接受尿路侵入性操作的患者[14]；
（2）与细菌生存环境有关，本研究结果显示，cylA和asa1基因在尿液样本分离菌株中的检出率显著高于血液样本分离菌株，这种在某个环境中出现频率显著增高的毒力基因被称为环境特异性毒力基因[12]，多种环境特异性毒力基因的协同作用可能是肠球菌尿路感染的致病机制之一；
（3）与生物膜形成能力有关，本研究结果显示，尿液样本分离肠球菌较血液样本分离菌株毒力基因种类更多；
有研究发现，致尿路感染菌株较致血流感染菌株更易形成生物膜[15]。本研究发现，不同部位分离同种菌株携带毒力基因的组合模式不同，尿液样本分离粪肠球菌以cylA-esp-asa1-gelE和cylA-esp-asa1组合较常见，而血液样本分离粪肠球菌却以单独携带gelE基因最常见。提示同种易感病原菌在不同的生理部位存在毒力差异，这种差异可能影响抗菌药物的治疗效果。

综上所述，相同样本来源粪肠球菌较屎肠球菌携带毒力基因种类更多，检出率更高；
相同菌种尿液样本分离株较血液样本分离株毒力基因携带率更高。毒力基因的差异可能导致菌株致病能力和对环境的适应性不同。按菌种和样本来源进行毒力基因分析，可为单一感染部位分离菌株致病机制研究提供参考。

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