高三尖杉酯碱通过抑制,ERK1/2,信号通路逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

程琛，杨建，秦公照，具晟

(1.南京医科大学附属苏州医院妇科，江苏 苏州 215002；
2.苏州大学附属第一医院胸外科，江苏 苏州 215001)

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，病死率较高，以顺铂(cisplatin，DDP)为基础的化疗是目前临床上常用的治疗手段之一，但长期使用DDP会引起耐药问题，寻找有效方法改善顺铂耐药可有效改善治疗效果[1]。高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)最初提取自海南三尖杉，用于治疗白血病，改善白血病耐药[2]。有研究[3-4]显示，HHT对鼻咽癌、肝癌等肿瘤有抑制功效，可促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。ERK是MAPK家族中发现较早的成员，其包括ERK1、ERK2等异构体，参与细胞增殖、分化、凋亡等多个生理过程的调控[5]。文献[6]表明，ERK1/2 信号在肿瘤中过度激活，抑制ERK1/2 信号可降低卵巢癌细胞增殖能力。HHT通过抑制ERK1/2 逆转黑色素瘤耐药[7]。目前尚未发现HHT对卵巢癌耐药的作用和影响机制的相关研究。本研究旨在探讨HHT调控ERK1/2 信号对卵巢癌细胞DDP耐药的影响，为临床改善卵巢癌DDP耐药，明确HHT抗肿瘤机制提供思路和依据。

1.1 材料

卵巢癌细胞A2780(美国ATCC)；
ERK1/2信号激活剂isoproterenol hydrochloride(ISO)(美国Sigma)；
兔抗Bax一抗(武汉菲恩生物科技有限公司)；
兔抗Bcl-2一抗(美国ABclonal)；
兔抗ERK1/2一抗、兔抗p-ERK1/2一抗(美国Santa Cruz Biotechnology)；
ERK1/2信号抑制剂PD98059(美国MedChemExpress)；
HHT(规格：25 mg，纯度：≥98.0%，成都普思生物科技股份有限公司)；
胎牛血清(美国GIBCO)；
DDP(美国Sigma)；
CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；
磷酸盐缓冲盐水(PBS)(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 卵巢癌细胞A2780培养在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，采用DDP浓度梯度法培养DDP耐药卵巢癌细胞A2780/DPP，建立耐药细胞株A2780/DPP[8]。在耐药细胞培养时添加2 nmol/L的DDP，用来维持细胞耐药性，培养箱的细胞培养参数为37 ℃，5% CO2。

1.2.2 实验分组 卵巢癌细胞A2780/DPP分为对照组、DDP组、HHT组、联合组、ERK1/2抑制剂组、DDP+ERK1/2抑制剂组、ERK1/2激活剂组、联合+ERK1/2激活剂组。对照组细胞正常培养；
DDP组细胞用80 μmol/L的DDP处理；
HHT组细胞用2 μmol/L的HTT处理；
联合组细胞用80 μmol/L的DDP和2 μmol/L的HTT联合处理；
ERK1/2抑制剂组细胞用25 μmol/L[9]的ERK1/2信号抑制剂PD98059处理；
DDP+ERK1/2抑制剂组细胞用80 μmol/L的DDP和25 μmol/L的ERK1/2信号抑制剂PD98059处理；
ERK1/2激活剂组细胞用20 μmol/L[10]的ERK1/2信号激活剂ISO处理；
联合+ERK1/2激活剂组细胞用80 μmol/L的DDP、2 μmol/L的HTT、20 μmol/L的ERK1/2信号激活剂ISO处理。各组细胞从实验0 h开始处理，48 h后，进行相关实验检测。

1.2.3 CCK-8实验检测细胞增殖 卵巢癌细胞A2780/DPP种植到96孔板内，每孔接种1×104个细胞，细胞贴壁以后，进行分组处理，每组设置3个复孔，并设置空白组，即孔内不添加细胞。48 h后，使用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。细胞存活率=[(实验组OD-空白组OD)÷(对照组OD-空白组OD)]×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 卵巢癌细胞A2780/DPP种植到6孔板内，每个孔中接种1×105个细胞，细胞贴壁后，进行细胞分组，48 h后，收集细胞(每个检测样本收集1×106个细胞)，2 000 g离心10 min，PBS洗涤细胞两次，用500 μL的结合缓冲液悬浮细胞，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，在室温条件下避光孵育15 min，上流式细胞仪测定。Annexin V-FITC激发波长488 nm，发射波长525 nm，PI激发波长535 nm，发射波长615 nm。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达 卵巢癌细胞A2780/DPP种植到6孔板内，每个孔中接种1×105个细胞，细胞贴壁后，进行细胞分组，48 h后，收集细胞，添加500 μL的细胞裂解液，放在冰上孵育60 min，4 ℃、12 000 g、离心10 min，吸取上清，经过比辛酸(Bisoctanoic acid，BCA)方法测定蛋白浓度。将蛋白与5×Loading Buffer混合煮沸5 min。进行SDS-PAGE凝胶电泳，在浓缩胶中利用80 V的电压电泳，在分离胶中使用120 V的电压电泳，200 mA转膜1.5 h。将PVDF膜置于50 g/L的脱脂奶粉中，室温结合1.5 h，然后放在一抗稀释液(Bax、Bcl-2、ERK1/2一抗按照1∶1 000稀释，p-ERK1/2一抗按照1∶600稀释)，4 ℃孵育过夜。再将PVDF膜放在二抗溶液(1∶4 000稀释)中，室温孵育1 h。使用ECL化学发光试剂盒分析目标蛋白。以β-actin作为内参，Image J扫描条带的灰度，根据条带的灰度值，计算目的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

2.1 HHT和DDP联合作用诱导卵巢癌细胞A2780/DPP凋亡

与对照组比较，DDP和HTT组卵巢癌细胞A2780/DPP存活率、凋亡率及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达无统计学差异(P>0.05)；
联合组卵巢癌细胞A2780/DPP存活率降低；
凋亡率明显升高；
促凋蛋白Bax表达增多；
抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 HHT和DDP联合作用可抑制卵巢癌细胞A2780/DPP中ERK1/2信号通路激活

与对照组比较，DDP组和HTT组卵巢癌细胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
联合组卵巢癌细胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 抑制ERK1/2信号可改善卵巢癌细胞A2780/DPP耐药

与对照组比较，DDP组卵巢癌细胞A2780/DPP细胞存活率、凋亡率及p-ERK1/2/ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
ERK1/2抑制剂组存活率降低；
凋亡率增加；
p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达减少；
Bax蛋白表达增多；
Bcl-2蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组、DDP组、ERK1/2抑制剂组比较，DDP+ERK1/2抑制剂组细胞存活率降低；
凋亡率增加；
p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达减少；
Bax蛋白表达增多(P<0.05)；
Bcl-2蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 激活ERK1/2信号对HTT影响卵巢癌细胞A2780/DPP耐药的逆转作用

与对照组比较，联合组卵巢癌细胞A2780/DPP细胞存活率降低，凋亡率增多，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；
ERK1/2激活剂组细胞存活率升高，凋亡率减少，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达增多，Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)。与联合组比较，联合+ERK1/2激活剂组卵巢癌细胞A2780/DPP细胞存活率升高，凋亡率减少，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达增多，Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

化疗是卵巢癌治疗的常见手段，而卵巢癌细胞产生化疗药物耐药是导致卵巢癌患者治愈率低的关键因素之一。DDP作为卵巢癌化疗常见药物，很多患者在治疗初期对DDP敏感，但最终产生DDP耐药，积极寻找有效方法改善卵巢癌DDP耐药有重要意义[11]。HHT存在于三尖杉属植物如三尖杉、海南粗榧中，临床上多用于治疗白血病[12]。有研究[13]显示，HHT不仅对血液肿瘤有良好的抑制效果，还可以抑制鼻咽癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡。HHT逆转黑色素瘤细胞耐药[7]。本研究显示，单独使用DDP或HHT对卵巢癌细胞A2780/DPP增殖影响不明显(P>0.05)，联合使用DDP和HHT可明显下调卵巢癌细胞A2780/DPP增殖活性(P<0.05)，提示HHT可逆转卵巢癌细胞A2780/DPP耐药。

肿瘤细胞凋亡减少对肿瘤快速增长具有重要意义，细胞凋亡涉及多个基因、信号通路、蛋白等的表达调控作用。其中Bcl-2蛋白家族成员较多，包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，分别在细胞凋亡过程中发挥诱导和抑制功效，Bax属于促凋亡蛋白而Bcl-2属于抗凋亡蛋白[14]。本研究发现，单独使用DDP或HHT对卵巢癌细胞A2780/DPP凋亡影响不明显(P>0.05)，DDP和HHT联合作用后卵巢癌细胞A2780/DPP凋亡率明显提高(P<0.05)，且Bax蛋白表达增多(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达减少(P<0.05)，说明HHT和DDP有协同促癌细胞凋亡的功效，进一步证明了HHT有逆转卵巢癌细胞A2780/DPP耐药的作用。MAPK是经典的信号通路，包括ERK等亚家族，ERK激活后进入细胞核，影响多种转录因子的活性，其中ERK1/2研究较多[15]。ERK1/2在肿瘤中发挥多种作用，不仅与细胞生长、凋亡等有关，还参与肿瘤耐药过程，ERK1/2激活诱发肿瘤获得性耐药，导致细胞不可控生长，促进免疫逃逸，降低药物敏感性[16]。文献[17]证实，ERK1/2在肿瘤中过度磷酸化，可诱导卵巢癌生长。本研究发现，HHT和DDP联合使用可诱导卵巢癌细胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达减少，并且ERK1/2信号抑制剂可逆转卵巢癌细胞A2780/DPP耐药，增加细胞凋亡，HHT作用机制可能与ERK1/2信号有关。进一步通过逆转实验验证显示，ERK1/2信号激活剂逆转HHT对卵巢癌细胞A2780/DPP耐药作用，说明HHT能够通过抑制ERK1/2信号逆转卵巢癌细胞A2780/DPP耐药。

综上，HHT对卵巢癌细胞A2780/DPP耐药有改善作用，机制可能与抑制ERK1/2信号有关，对卵巢癌DDP耐药临床治疗有重要意义。

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