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MK571通过激活法尼醇X受体抑制肝脏胆汁酸合成

发布时间:2023-04-07 16:10:12 浏览数:

张明康,周燕,陈宇玥,勾雪艳,武新安,3

(1.兰州大学药学院,甘肃兰州 730020;
2.兰州大学第一医院药剂科,甘肃 兰州 730000;
3.甘肃省临床用药风险防控工程研究中心,甘肃 兰州 730000)

胆汁酸主要由肝细胞合成并储存在胆囊中,是体内胆固醇代谢的重要途径[1-2]。胆汁酸合成途径主要有两条,经典途径和替代途径。经典途径主要由胆固醇-7α-羟化酶(cholesterol-7α-hydroxylase,CYP7A1)和胆固醇-12α-羟化酶(cholesterol-12αhydroxylase,CYP8B1)介导,产生至少70%的胆汁酸[3]。替代途径主要由胆固醇-27α-羟化酶(choles‐terol-27α-hydroxylase,CYP27A1)介导[4-5]。胆汁酸的排泄主要通过胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistanceassociated protein 2,MRP2)排出[6]。此外胆汁酸还通过Na+依赖性牛磺胆酸协同转运蛋白(Na+tauro‐cholate cotransporting polypeptide,NTCP)和有机阴离子转运多肽2(organic anion transportingpolypep‐tide 2,OATP2)被肝细胞重吸收。法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)是肝脏和肠道中的胆汁酸的传感器。细胞内胆汁酸浓度升高会激活FXR的转录,减少CYP7A1的表达,抑制胆汁酸合成。此外通过抑制NTCP的表达负调节肝细胞对胆汁酸的摄取,促进BSEP的表达,增加胆汁酸的排泄[7]。胆汁酸代谢紊乱与肝胆代谢疾病密切相关[8]。胆汁酸的积累会形成不溶性盐,并在胆管中沉淀,最终导致胆汁淤积,肝细胞损伤甚至肝硬化坏死[9-10]。因此胆汁酸的蓄积已成为诱发胆汁淤积,肝细胞和胆管细胞损伤的重要因素[11]。

MK571是 一 种 白 三 烯D4(leukotriene D4,LTD4)和半胱氨酰白三烯受体1(cysteinyl leukotri‐ene receptor 1,CYSLTR1)抑制剂。据报道MK571可以通过调节细胞因子、粘附分子和阻止内皮氧化型谷胱甘肽的输出,缓解氧化应激,减轻炎症[12-13]。MK571已成功应用于气道过敏、肺部炎症和肾损伤等疾病[14]。此外MK571也是一种常用的多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRPs)抑制剂。抑制MRP5可以显著减轻大鼠败血症引起的急性肺损伤[13,15]。同时MRP2作为肝脏胆汁酸另一条排泄途径,受到MK571的抑制。然而目前关于MK571对胆汁酸合成影响的研究很少,机制更是不明。鉴于胆汁酸在肝损伤中的作用不可忽视,因此本研究主要探讨MK571对肝脏胆汁酸合成及其调节蛋白的影响。

1.1 试验动物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,6~8周龄,体质量180~200 g,购自兰州兽医研究所实验动物中心,实验动物证号为SCXK(甘)2020-0002,饲养于兰州大学药学院动物房,室温25℃,昼夜12 h交替,试验期间动物可以自由进食、饮水。所有试验程序和动物护理均在尽量减少动物痛苦的条件下进行,并严格遵循兰州大学动物伦理委员会的指导。

1.2 试验材料

MK571钠盐(纯度>98%)(美国Med Chem Express公 司);
CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、BSEP和NTCP抗体(美国Abcom公司);
FXR和CYP7A1抗体(美国Santa Cruz公司);
RIPA裂解缓冲液(美国Thermo公司);
其余试剂为国产分析纯。

OLYMPUS AU400全自动生化分析仪(日本OLYMPUS光学株式会社);
17/17R低温高速离心机(美国Thermo公司);
Smart WLI光学显微镜(德国GBS公司);
LT-224S分析天平(北京赛多利斯公司)。

1.3 动物分组及试验

供试SD大鼠适应性喂养1周后,根据体质量随机分为4组:MK571低、中、高剂量组和对照组,每组6只,分别每天腹腔注射5、10、20 mg/kg MK571和等体积生理盐水,连续给药7 d,每2 d记录一次大鼠的体质量。

1.4 大鼠肝功能指标含量检测

所有大鼠最后一次处理后,禁食过夜,次日用适量的乙醚麻醉。从腹主动脉获取3 mL血液样品,立即以8 000 r/min离心10 min获得血清,采用全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)含量。剩余血清储存在-80℃冰箱中用于后续分析。

1.5 苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠肝组织病理学变化

收集完血液样品后,立即采集肝组织。一部分放入液氮中快速冷冻,随后转移到-80℃冰箱。另一部分置于4%中性甲醛固定液中固定24 h,用于后续病理分析。HE染色:常规制备肝石蜡切片,梯度乙醇脱蜡,苏木精伊红染色,脱水,中性树胶封片,再加盖玻片,在光学显微镜下观察染色情况。

1.6 UPLC-MS/MS测定大鼠血清和肝脏胆汁酸含量

取出低温储存的血清和肝脏样品,使用UPLCMS/MS方法检测胆汁酸含量。流动相由乙酸铵-氨水溶液(A)(7.5 mmol/L乙酸铵,0.1%氨水,pH 7.5)和甲醇(B)组成。色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)。梯度洗脱比例:0~1 min,45% B→50% B;
1~2 min,50% B→65% B;
2~4 min,65% B;
4~7 min,65% B→90%B;
7~7.01 min,90% B→45% B;
7.01~14 min,45%B。具体检测条件见表1,注射体积为10µL,流速为0.2 mL/min,柱温保持在30℃。

表1 胆汁酸的UPLC-MS/MS分析方法Table 1 UPLC-MS/MS analysis methods of bile acids

1.7 蛋白免疫印迹法分析

使用适量RIPA裂解缓冲液(RIPA∶PMSF=99∶1,V/V)裂解肝组织,BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度以便调整上样量。再通过SDS-PAGE电泳分离得到不同分子量的蛋白质,并转移到PVDF膜上,然后用脱脂牛奶在室温下封闭1 h。之后PVDF膜 分 别 与 抗NTCP(Abcom,ab131084,1∶1 000)、抗CYP7A1(Santa Cruz,sc-25536,1∶1 000)、抗CYP27A1(Abcom,ab126785,1∶1 000)、抗CYP7A1(Abcom,ab191910,1∶1 000)、抗FXR(Santa Cruz,sc-25309,1∶500)、抗-β-actin(1∶3 000)抗体4℃摇床过夜。然后将膜在HRP偶联的二抗(1∶4 000)中孵育1 h,并使用增强化学发光液进行检测。最后用Image J软件进行灰度值统计。

1.8 统计分析

利用SPSS 17.0软件进行数据统计分析,多组间比较采用单因素方差分析。试验中所有结果用表示,P<0.05表示差异显著。采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2.1 MK571对大鼠肝功能生化指标的影响

当肝脏受到损伤时,肝细胞膜通透性发生改变,血中AST和ALT水平升高[16]。由表2可知,与对照组相比,MK571干预后血清AST含量呈上升趋势但无显著性差异。高剂量组血清ALT水平显著性降低(P<0.05)。中、高剂量组AST/ALT比值显著性上升(P<0.05)。这些结果表明当给予高剂量的MK571时会造成轻微的肝损伤。同时中、高剂量组TBIL和TBA含量均显著降低(P<0.05)。因此认为,MK571可引起轻微肝损伤,并降低血清TBA和TBIL含量.

表2 各组大鼠肝脏生化指标变化(n=6)Table 2 Changes of liver biochemical indexes of rats in each group(n=6)

2.2 MK571对肝脏组织病理学变化的影响

HE染色结果见图1。对照组肝细胞形态规则,排列规则,并且肝脏未出现炎症细胞浸润、胆管扩张等病理损伤。但高剂量组肝脏汇管区出现炎症细胞浸润(红色箭头),部分肝细胞出现嗜酸性病变。HE结果显示短期低剂量MK571不会引起肝细胞损伤,但高剂量MK571会引起肝脏轻度炎症。

图1 光学显微镜下肝组织HE染色结果观察(×200)Figure 1 Observation of liver tissue HE staining result under an optical microscope(×200)

2.3 MK571对血清和肝脏胆汁酸含量的影响

胆汁酸存在于肝、胃、肾、脑和心脏等不同的器官中,拥有相同的初级胆汁酸(CA和CDCA)[17-18]。在啮齿动物中,CDCA可被羟基化为α-鼠胆酸(α-MCA),并进一步转化为β-鼠胆酸(β-MCA)。并且在大鼠血浆中,β-MCA和CA含量约占总胆汁酸的1/3。在人血浆中,GCDCA和GCA含量约占总胆汁酸的1/2[5]。

大鼠血清胆汁酸的含量检测结果见图2-A。与对照组相比,低、中、高剂量组大鼠血清GCA、CDCA含量显著降低(P<0.05);
中、高剂量组血清LCA、GUDCA、GCDCA、CA含量显著降低(P<0.05);
高剂量组血清TCA和GDCA含量显著降低(P<0.05);
然而,中、高剂量组UDCA含量显著升高(P<0.01)。结果表明MK571干预后,大鼠血清中初级胆汁酸(CA和CDCA)含量显著减少;
甘氨酸结合的胆汁酸(GCA,GUDCA,GCDCA,GDCA)和牛磺酸结合的胆汁酸(TCA)显著减少;
UDCA含量显著升高(P<0.05).

大鼠肝脏胆汁酸的含量检测结果见图2-B。与对照组相比,低、中、高剂量组肝脏GCA、GCDCA、TUDCA(中剂量除外)含量均显著降低(P<0.05);
中、高剂量组肝脏中GUDCA、UDCA、β-MCA的含量显著降低(P<0.05);
高剂量组肝脏中CDCA和GDCA的含量显著降低(P<0.05);
然而高剂量组DCA和LCA含量显著升高(P<0.05)。结果表明MK571干预后,大鼠肝脏中初级胆汁酸(β-MCA和CDCA)含量显著降低(P<0.05);
甘氨酸结合的胆汁酸(GCA、GUDCA、GCDCA、GDCA)和牛磺酸结合的胆汁酸(TUDCA)含量均显著减少(P<0.05)。结合血清和肝脏中的胆汁酸含量变化,发现MK571干预后,血清和肝脏中初级胆汁酸和牛磺酸/甘氨酸结合胆汁酸含量均出现显著性降低。此外发现MK571可以增加血清中UDCA含量和肝脏中DCA和LCA含量。

图2 大鼠血清和肝脏胆汁酸的含量Figure 2 The content of bile acids in the serum and liver of rat

2.4 MK571对大鼠血清和肝脏胆汁酸组成的影响

试验发现在正常大鼠体内,游离型胆汁酸在血清中占大多数(图3-A),而牛磺酸结合的胆汁酸在肝脏中占大多数(图3-B)。此外随着MK571的干预,血清游离型胆汁酸比例增加,牛磺酸结合型胆汁酸的比例下降;
在肝脏中,甘氨酸结合型胆汁酸的比例下降,牛磺酸结合型的胆汁酸比例增加。这些结果表明大鼠血清主要含有游离型胆汁酸,肝脏主要含有结合型胆汁酸,尤其是牛磺酸结合型胆汁酸。MK571干预后,大鼠血清和肝脏中游离型和结合型胆汁酸的比例发生变化。据此认为MK571可影响大鼠血清和肝脏胆汁酸组成。

图3 血清和肝脏中游离型和牛磺酸/甘氨酸结合型胆汁酸的比例Figure 3 The proportion of unconjugated and taurine/glycine conjugated bile acids in the serum and liver

2.5 MK571对肝脏胆汁酸相关调节蛋白的影响

胆汁酸的合成和排泄受许多代谢酶和转运蛋白的调控。当给予MK571后,大鼠血清中总胆汁酸含量显著降低,血清和肝脏中初级胆汁酸和甘氨酸/牛磺酸结合型胆汁酸含量显著降低。蛋白免疫印迹法结果显示(图4)与对照组相比,中、高剂量组FXR、BSEP和NTCP的表达量均显著增加(P<0.05);
低、中剂量组CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1的表达量均显著降低(P<0.05)。以上结果表明MK571可激活FXR,下调CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的表达,减少肝脏中胆汁酸的合成;
上调BSEP的表达,促进胆汁酸的排泄。同时发现MK571对上述胆汁酸相关代谢酶和转运蛋白的影响不呈现剂量依赖性。

与空白组比较,**表示P<0.01;
*表示P<0.05。Compared with the control group,**represent P<0.01;
*rep‐resent P<0.05.

胆汁酸存在于不同的器官中,并且以不同的形式(共轭/非共轭)和不同的比例存在[17]。据报道,通过检测胆汁酸含量变化来检测肝病要比一些传统的方法更灵敏、更准确[8],其中用血清胆汁酸水平变化诊断肝病更灵敏可靠[19]。人体内每天有将近500 mg的胆固醇转化为胆汁酸[20]。胆汁酸的主要合成部位是肝脏,同时受许多代谢酶的调控,CYP7A1主要催化CA和CDCA的合成,CYP8B1催化CA的合成,CYP27A1和CYP7B1催化CDCA的合成[4,21]。此外许多转运蛋白负责胆汁酸的排泄和重吸收。BSEP是胆汁酸主要的外排转运蛋白,几乎只在肝脏中表达,介导95%的胆汁酸排泄到胆汁中[22-23]。NTCP和OATP2主要负责胆汁酸的重吸收[6]。FXR在维持胆汁酸稳态方面起着至关重要的作用。当FXR被激活时,FXR通过诱导其下游靶基因小分子异二聚体伴侣受体(SHP)或成纤维细胞生长因子15/19(FGF15/19)的活性来抑制胆汁酸的合成[24]。已有研究报道大黄素通过增加FXR和BSEP的mRNA水平和蛋白质表达对小鼠胆汁淤积具有保护作用[25]。同时胆汁酸不仅是FXR的天然配体,还对FXR具有调节作用[10,26]。例如CDCA毒性较小,是一种有效的FXR配体;
T-β-MCA和T-α-MCA是FXR拮抗剂[18]。据报道胆汁酸对FXR的亲和力为:CDCA>LCA>DCA>CA,激活力为:CDCA>DCA>LCA[24]。本研究发现大鼠腹腔注射不同剂量的MK571后,血清总胆汁酸含量显著下降;
大鼠肝脏中FXR和BSEP的表达显著升高,CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达量均有不同程度的降低;
血清和肝脏初级胆汁酸和结合型胆汁酸含量显著降低。此外发现肝脏LCA和DCA的含量显著升高,以上结果提示LCA和DCA含量的增加激活了FXR通路,下调肝脏CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达,上调BSEP的表达,可显著降低大鼠血清和肝脏胆汁酸的含量。在生理条件下人体中大多数胆汁酸与甘氨酸结合,而在大鼠中,胆汁酸与牛磺酸结合物占大多数[27-28]。此外甘氨酸结合的胆汁酸与肝损伤呈正相关[29],牛磺酸结合的胆汁酸对血管舒张和内皮功能障碍具有有益作用,并且已成为门静脉高压症的潜在治疗方法[30]。本试验发现随着MK571的干预,血清和肝脏总胆汁酸的组成结构会发生变化。血清中游离型胆汁酸比例增加,牛磺酸结合型胆汁酸的比例下降;
肝脏中甘氨酸结合型胆汁酸的比例下降,牛磺酸结合型的胆汁酸比例增加。上述结果提示MK571在肝脏疾病方面具有潜在治疗作用,但仍需要进一步深入探究。

MK571通过激活FXR,下调肝脏CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达,上调BSEP的表达,显著降低大鼠肝脏胆汁酸的合成。

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