紫荆、湖北紫荆中单宁化学结构及其抗氧化活性研究

王明豪， 张静涵， 赵京轲， 张亮亮， 骆嘉言*

(1.南京林业大学 材料科学与工程学院，江苏 南京 210037；

2.华侨大学先进碳转化技术研究院，福建 厦门 361021)

紫荆，为本土豆科植物，在我国有着广泛的栽培，有重要的药用价值。湖北紫荆，又名巨紫荆，为紫荆的近属种，是一种主要用于园林绿化的乔木，尚无对其化学成分进行研究的报道，有待于对其开展研究从而进行开发利用。现有研究表明，紫荆中富含黄酮类化合物[1]，而黄酮类化合物与植物中的缩合单宁有着密切的生源关系。缩合单宁又称聚黄烷醇类多酚，是植物体内产生的一类衍生于黄烷化合物的多酚类物质,为羟基黄烷类单体组成的缩合物[2]，绝大部分为多聚原花色素，是一种多分散体系。实际上人们很难通过分离纯化获得单一结构的纯的多聚原花色素，往往只能得到相对分子质量在一定范围内的多聚原花色素，因而对所获得的多聚原花色素组分进行准确的结构特征描述是非常重要的[3]。多酚类化合物作为植物的次生代谢产物，广泛存在于植物界，可以帮助植物免受病原菌、真菌及昆虫的侵害[4]。此外，单宁还具有多种生物活性，抗氧化活性便是其中之一[5]。本研究对紫荆和湖北紫荆不同部位缩合单宁的含量进行了测定，通过NMR、RP-HPLC技术对紫荆及湖北紫荆单宁化学结构开展研究，并对其抗氧化能力进行了测定，以期为更好地开发利用紫荆、湖北紫荆资源提供理论基础。

1.1 原料、试剂与仪器

紫荆(CercischinensisBunge)、湖北紫荆(CercisglabraPampan.)叶片2021年7月采于南京林业大学校园内，湖北紫荆荚果2021年9月采于南京林业大学校园内，洗净后于-20 ℃保存。丙酮、甲醇、盐酸、醋酸、醋酸钠、正丁醇、苄硫醇、三氟乙酸、三氯化铁，均为国产分析纯试剂；
乙腈为色谱纯；
色谱填料Sephadex LH-20，Cytiva公司；
氘代丙酮、氘代水，北化二厂；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，Sigma公司；
丁基羟基茴香醚(BHA，纯度98%)、抗坏血酸(Vc)，分析标准品，上海麦克林生化科技有限公司；
一级水。

JJ-2BS组织捣碎机，中国VRERA公司；
FD-1型冷冻干燥机，日本EYEIA公司；
Cary 8454型紫外/可见分光光度计，美国Agilent公司；
AvanceⅢ 600MHz高分辨核磁共振仪，德国Bruker公司；
LTQ Orbitrap XL液相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司。

1.2 缩合单宁的提取与纯化

新鲜紫荆叶、湖北紫荆叶片及荚果洗净后-20 ℃冰冻，冻干机中冻干后用组织捣碎机研磨成粉，储藏于-20 ℃备用。取20 g植物材料粉末，加入200 mL 70%(体积分数，下同)丙酮，浸提1 h，重复3次，合并提取液在45 ℃下旋蒸去除丙酮和部分水，水相冷冻干燥后得到单宁粗提物。粗提物用少量50%(体积分数，下同)甲醇溶液溶解后上Sephadex LH-20色谱柱，用50%甲醇溶液淋洗去除杂质，70%丙酮溶液洗脱并收集纯化的单宁组分。45 ℃旋转减压蒸发除去丙酮和部分水，剩余水相冷冻干燥，即得纯化单宁。样品置于-20 ℃下保存备用，所有后续分析均使用该纯化后的样品。

1.3 可溶缩合单宁含量的测定

1.3.1样品溶液的制备 取0.1 g 3种植物原料粉末，与2 mL 70%丙酮溶液混合，于25 mL容量瓶中用甲醇定容，室温下避光保存。

1.3.2可溶缩合单宁含量的测定 参考文献[6]的方法，取1 mL过滤后的样品溶液，加入6 mL正丁醇-盐酸(体积比95 ∶5，下同)溶液，沸水浴处理75 min。冷却至室温后在550 nm处用分光光度计测定其吸光度，甲醇作为空白对照。

1.3.3标准曲线的绘制 为得到更为真实的单宁含量测定结果，以纯化后的植物单宁作为标准品，纯化后单宁经HPLC法检测，纯度均达到95%以上。将纯化得到的植物单宁样品配置成质量浓度梯度为0、 100、 200、 300、 400和500 mg/L的甲醇溶液，各质量浓度取1 mL，加入6 mL正丁醇-盐酸溶液，按上述方法处理后，测定吸光度并绘制成相应的标准曲线，可得紫荆叶片单宁含量标准曲线y=0.965 2x+0.014 6(R2=0.996 5)、湖北紫荆叶片单宁含量标准曲线y=1.043x+0.035 7(R2=0.99)、湖北紫荆荚果单宁含量标准曲线y=1.034 4x-0.003 6(R2=0.993 4)。

1.4 可溶缩合单宁结构分析

1.4.1液体13C NMR分析 参考文献[7]的方法，缩合单宁的液体13C NMR用AvanceⅢ 600MHz高分辨核磁共振仪测定。120 mg的纯化缩合单宁用1 mL体积分数为95%的氘代丙酮溶液溶解后，转移到直径5 mm的核磁管中；
在反转门控去偶条件下测定13C NMR谱，扫描频率为125.78 MHz，脉冲角为45°，延迟时间为3 s。

1.4.2HPLC-MS分析 样品在HPLC分析之前，需先经过苄硫醇的醇解。首先配置3.3%(体积分数，下同)的盐酸-甲醇溶液、 5%(体积分数，下同)苄硫醇-甲醇溶液及5 g/L的纯化缩合单宁甲醇溶液。反应时，取50 μL样品，50 μL 3.3%盐酸-甲醇溶液和100 μL 5%苄硫醇-甲醇溶液，充分混匀后40 ℃水浴30 min，0.45 μm滤膜过滤。

将经苄硫醇硫解的样品上机进样20 μL，色谱柱为Hypeisil Gold反相柱(100 mm×2.1 mm，5 μm)，0.1%甲酸和乙腈为洗脱剂。流程设定如下：0～15 min，12%～80%乙腈(线性梯度)；
15～20 min，80%～95%乙腈；
20～26 min，95%乙腈；
26～27 min，12%乙腈；
27～30 min，100%乙腈(线性梯度)。柱温控制在25 ℃，洗脱液流速为0.5 mL/min，检测波长为280 nm，紫外光谱检测范围设置在200～600 nm。

ESI离子源负离子扫描；
扫描范围(m/z)为100～1 500；
雾化器温度350 ℃，雾化器流速10 L/min，雾化器压力241.38 kPa，雾化器电压3.5 kV。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1DPPH自由基清除率 DPPH自由基(DPPH·)清除率的测定参照Chen等[8]的方法，略作改动。配置500 mg/L 的纯化单宁样品甲醇溶液，并使用二倍稀释法，得到质量浓度为500、 250、 125、 62.5和31.25 mg/L 的系列样品甲醇溶液，取不同质量浓度的样品溶液0.1 mL与质量分数0.004%的DPPH甲醇溶液3 mL于10 mL试管中，摇匀后室温下静置反应30 min,使用紫外分光光度计在517 nm处测定吸光度(AS)；
以甲醇为空白对照，测定其在517 nm处的吸光度值(A0)。以BHA、Vc为阳性对照，配置500、 250、 125、 62.5和31.25 mg/L系列工作溶液，测定吸光度，按下式计算DPPH·清除率(η)：

η=(A0-AS)/A0×100%

1.5.2总抗氧化能力 参考Benzie等[9]的方法，采用铁离子还原/抗氧化能力(FRAP)分析法测定纯化单宁样品的总抗氧化能力。首先，将0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液、 10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以体积比10 ∶1 ∶1混合，配制TPTZ工作溶液。取质量浓度为15.625～250 mg/L的各样品、对照品溶液0.1 mL，加入3 mL TPTZ工作溶液，混匀后25 ℃反应5 min，593 nm处测定吸光度值。

配置0.2、 0.4、 0.6、 0.8和1.0 mmol/L的Vc标准液，以甲醇为空白对照。各标准溶液分别与TPTZ工作液反应5 min，593 nm处测得吸光度值，绘制标准曲线,可得：y=1.279 6x+0.038 4(R2=0.999 3)。总抗氧化能力以达到相同抗氧化能力的Vc的量(mmol/g)来表示。

2.1 可溶性缩合单宁含量

经测定，紫荆叶片、湖北紫荆叶片和湖北紫荆荚果3种植物原料的可溶缩合单宁质量分数分别为(151.56±13.64)、(96.75±13.96)和(198.12±7.24) mg/g。结果显示：3种植物原料均具有较高的单宁含量，其中湖北紫荆荚果中可溶缩合单宁含量最高，紫荆叶片次之，湖北紫荆叶片中含量最低。

2.2 可溶性缩合单宁的结构分析

2.2.113C NMR分析 通过13C NMR技术对缩合单宁进行分析，可以得到其基本结构单元的组成及其连接方式的信息。紫荆叶片、湖北紫荆叶片及荚果缩合单宁的液态13C NMR分析图谱见图1，相关化合物结构式见图2。结果分析参考已报道的解析图谱峰信号的相关文献[10-12]。

图1 紫荆叶片(a)、湖北紫荆叶片(b)和湖北紫荆荚果(c)缩合单宁13C NMR图谱Fig.1 13C NMR spectra of condensed tannins from C. chinensis(a), C. glabra leaves(b) and pod(c)

图2 图2 原花青素(PC)、原翠雀素(PD)和原天竺葵素(PP)的结构Fig.2 Structure of procyanidin(PC), prodelphinidin(PD) and propelargonidin(PP)

由图1和图2可知，δ157处的信号峰为PP或PD单元的C4’，而δ157～150间出现的峰值为PC或PD单元的C5、C7和C8a。δ146出现的峰值为PD单元的C3’和C5’，PC单元的C3’、C4’在δ145处出现峰值。PD的C4’与PC、PD的C1’均在δ131附近出现峰值。δ119出现的峰可认定为PC单元的C6’，δ116 处出现的信号峰则为PC单元的C2’和C5’。δ110～90之间出现的聚集峰代表着PC单元的C8、C4a和C6以及PD单元的C4a、C6、C8、C2’和C6’，此外δ104～102处出现信号峰代表着A型连接的存在。δ90～70之间是缩合单宁结构单元的C2，其出现的位置代表着黄烷-3-醇结构单元的顺式(2,3-cis)和反式(2,3-trans)结构。以δ80为分界线，反式黄烷-3-醇单元C2的信号峰出现在δ85～80处，而顺式黄烷-3-醇的信号峰则出现在δ80～75处。而顺式反式对C3的化学位移并无太大影响，延伸单元C3顺式和反式异构体的信号峰均位于δ72处。δ36处的峰则代表着延伸单元的C4。此外，δ164、 147、 140、 122以及110等处峰值信号则表明缩合单宁结构单元C3上存在有棓酰基取代。

由图谱分析可知，紫荆叶片、湖北紫荆叶片及荚果缩合单宁均由PC、PD、PP 3种基本结构单元构成。通常而言，由于PC单元B环的C3’、C4’和PD单元的C3’、C5’具有相同的弛豫时间和核欧沃豪斯效应，对二者峰面积积分可得到2种结构单元的构成比例。然而，通过分析图谱可知，3种缩合单宁中均存有一定数量的棓酰基取代，棓酰基上C3、C5的化学位移与PD结构单元的C3、C5存在重叠，故而难以精确量化PC、PD单元的构成比例。通过对比分析δ84及δ77的峰值可知，3种缩合单宁的结构单元均主要呈顺式异构。

2.2.2HPLC-MS分析 将缩合单宁样品硫解后进行RP-HPLC-ESI-MS分析，可以判断其末端单元以及延伸单元的化学组成。苄硫醇作为亲核试剂，在酸性条件下可以使缩合单宁得到有效的降解，破坏缩合单宁基本结构单元的连接键，从而得到末端单元和延伸单元，其中末端单元以游离的黄烷-3-醇的形式解离出来，而延伸单元则以苄硫醇加合物的形式存在。对经苄硫醇硫解的3种植物缩合单宁样品进行RP-HPLC-ESI-MS分离鉴定，总离子流图如图3所示，参考文献[13-15]对其末端单元及延伸单元与苄硫醇的加合物进行了分析鉴定。

1.儿茶素/表儿茶素catechin/epicatechin(C/EC)；

2.棓儿茶素棓酸酯/表棓儿茶素棓酸酯gallocatechin gallate/epigallocatechin gallate(GCG/EGCG)；

3.儿茶素棓酸酯/表儿茶素棓酸酯catechin gallate/epicatechin gallate(CG/ECG)；

4.棓儿茶素/表棓儿茶素苄硫醚gallocatechin/epigallocatechin-benzylthioethers(GC/EGC-thio)；

5.未知unknow; 6.儿茶素/表儿茶素苄硫醚C/EC-thio；

7.儿茶素/表儿茶素-阿福豆素/表阿福豆素C/EC-afzelechin/epiafzelechin(AF/EAF)图3 紫荆叶片(a)、湖北紫荆叶片(b)和湖北紫荆荚果(c)缩合单宁HPLC-MS总离子流图Fig.3 HPLC-MS total ion flow chromatograms of condensed tannins from C. chinensis(a), C. glabra leaves(b) and pod(c)

在负离子模式下，化合物1的[M-H]-峰为m/z289.1，同时质谱图上还出现了m/z325.0[M+Cl]-的峰，m/z579.2的[2M-H]-峰，m/z615.1的[2M+Cl]-峰，与文献[13]比对后鉴定为儿茶素/表儿茶素(C/EC)。化合物2的[M-H]-峰为m/z457.1，化合物3的[M-H]-峰为m/z441.1，参考相关文献[14]可推测其可能为棓儿茶素棓酸酯/表棓儿茶素棓酸酯(GCG/EGCG)及儿茶素棓酸酯/表儿茶素棓酸酯(CG/ECG)。化合物4的[M-H]-峰为m/z427.1，同时质谱图上还可以检测到m/z303.0的[M-SC7H7-H2-H]-峰，m/z855.2的[2M-H]-峰；
化合物6的[M-H]-峰为m/z411.1，同样质谱图上可以检测到m/z287.0的[M-SC7H7-H2-H]-峰，m/z823.2的[2M-H]-峰。与文献[13]比对判定化合物4及化合物6分别为棓儿茶素/表棓儿茶素苄硫醚及儿茶素/表儿茶素苄硫醚的一系列同分异构体。化合物7的[M-H]-峰为m/z563.1，参考文献[15-16]推测其为由儿茶素/表儿茶素与阿福豆素/表阿福豆素(C/EC-AF/EAF)组成的B型连接的二聚黄烷-3-醇。根据主要色谱峰的保留时间、特征离子峰、分子质量，将推测化合物总结于表1，其中尚有一种化合物无法辨别。

表1 3种植物的缩合单宁HPLC-MS定性分析结果Table 1 Qualitative analysis results of condensed tannins from three plants by HPLC-MS

根据质谱鉴定结果可以推断，3种单宁的末端单元均主要由C/EC构成，并根据检测出的黄烷-3-醇苄硫醚加合物可以判断其延伸单元主要为C/EC及棓儿茶素/表棓儿茶素。此外质谱图中虽未检测到阿福豆素/表阿福豆素苄硫醚的存在，但化合物7可能代表着由C/EC与AF/EAF组成的B型二聚黄烷-3-醇的存在，因而不能排除延伸单元中AF/EAF的存在。此外，结合文献还鉴定出了GCG/EGCG及CG/ECG，表明3种单宁均存在棓酰基取代，与核磁结果相吻合。由此可知，3种缩合单宁均主要由原花青素及原翠雀素组成，且均存在着棓酰基取代。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1DPPH·清除能力 以50%自由基清除时抑制剂的质量浓度(IC50)表示3种缩合单宁对DPPH·的清除能力。从图4(a)可以看出，3种缩合单宁样品对DPPH·均有较好的清除能力，IC50值均低于阳性对照组BHA(134.11 mg/L)，其中紫荆叶片及湖北紫荆荚果缩合单宁表现出较为突出的DPPH·清除能力，其IC50值分别为69.67和67.02 mg/L，略低于阳性对照组Vc(76.65 mg/L)；
而湖北紫荆叶片缩合单宁的DPPH·清除能力则要稍弱一些，其IC50值为97.70 mg/L，要显著高于Vc。

图4 不同样品中单宁对DPPH·的清除能力(a)及FRAP(b)Fig.4 DPPH· scavenging activities(a) and FRAP(b) of tannins from different samples

2.3.2总抗氧化能力 从图4(b)和表2可以看出，随着单宁质量浓度增加，所有样品的吸光度值均有所提高，表2中对应的 FRAP值则在一定范围内波动。

表2 不同样品中单宁的总抗氧化能力Table 2 Total antioxidant activities of tannins from different samples

由表2可知，当质量浓度为125 mg/L以下时，紫荆叶片单宁的FRAP值要高于阳性对照BHA及其他两种单宁样品；
当质量浓度为125 mg/L及以上时，各组FRAP值趋于稳定，此时各组吸光度值的大小关系为：BHA>紫荆叶片单宁>湖北紫荆叶片单宁>湖北紫荆荚果单宁。

取125 mg/L时的FRAP值作为总抗氧化能力值。由表2结果可以发现，此时，3种植物缩合单宁样品的FRAP值都要低于阳性对照BHA，表明样品的总抗氧化能力要弱于BHA。在3种样品中，紫荆叶片单宁表现出了最好的总抗氧化性，其FRAP值为(5.56±0.08)mmol/g，仅略低于阳性对照BHA(6.51±0.15 mmol/g)。而湖北紫荆果荚单宁虽然在DPPH自由基清除能力测试中表现良好，但其总抗氧化能力最弱，FRAP值仅为(3.51±0.39) mmol/g。

3.1紫荆叶片、湖北紫荆叶片和荚果的单宁含量测定结果表明：3种紫荆原料中可溶性缩合单宁质量分数均较高，在96.75～198.12 mg/g之间。

3.2通过13C NMR和HPLC-MS分析方法对缩合单宁的化学结构进行了分析，结果表明：3种缩合单宁均主要由原花青素(PC)及原翠雀素(PD)组成，且均存在着棓酰基取代。

3.33种缩合单宁样品均表现出了一定的抗氧化活性，其中紫荆叶片及湖北紫荆荚果单宁对DPPH·表现出较为突出的清除能力，其IC50值分别为69.67和67.02 mg/L，略低于阳性对照Vc(76.65 mg/L)；
紫荆叶片单宁还表现出良好的总抗氧化能力，是值得开发的天然抗氧化剂。

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