基于疾病基因表达谱和药物转录组的抗高尿酸血症药物“重定位”

逄成章 刘文彬 金小宝

1广东药科大学生命科学与生物制药学院（广州 510006）；
2广东省生物活性药物研究重点实验室（广州 511436）

高尿酸血症（HUA）是一种由于嘌呤代谢紊乱所引起的血尿酸浓度超出标准范围的慢性代谢性疾病。研究表明，HUA是引发痛风的重要因素，也可引起冠心病［1］、高血压［2］、糖尿病［3］。目前 HUA的治疗主要包括两个途径：一是促进尿酸代谢，此类药物抑制近端肾小管对尿酸的重吸收而达到促进尿酸外排，如苯溴马隆［4］、丙磺舒［5］等；
二是抑制尿酸产生，如黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇［6］。但上述药物在使用过程皆伴随着不同程度的副作用，因此，开发新型抗尿酸药物具有重要意义。

新药开发是一个耗时、昂贵和有风险的过程。近年来许多药物被批准用于其他适应证［7］，老药新用策略应运而生，即利用目前已知药物并发掘活性药物成分重新治疗新的适应症。与传统新药研发相比，基于现有药物研究的优势，可克服在新药研发领域所投入的大量资金、规避新药研发失败风险和减短新药上市周期等［8］。基因表达谱技术可以通过对比疾病前后基因表达的差异，分析疾病发病机理和潜在药物作用靶点，建立“靶点-疾病”间的关联。因此，本研究使用疾病基因表达谱获得的“靶点-疾病”信息与药物转录组获得的“靶点-药物”信息进行相关性分析，预测潜在的HUA治疗药物，并进行体外细胞实验验证，本研究为新型抗HUA药物的研发提供一种新的方法和视角。

1.1 细胞株来源 人肾小管上皮细胞系HK-2，由广东省生物活性药物研究重点实验室提供，保存于-80℃冰箱。

1.2 试剂与仪器 阿维菌素（Solarbio，批号：No.410BO21）；
黄嘌呤氧化酶（XOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20220523）；
尿酸（UA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：190706）；
腺苷（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C13160852）；
全自动酶标仪ELx800（美国Bio-Tek公司）。

1.3 HUA差异表达基因谱的筛选与分析 通过GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检索HUA相关的转录组数据，筛选对HUA基因表达谱芯片。以P＜0.01，logFC≥1或logFC≤-1为筛选条件，利用Bioconductor软件对差异表达基因进行筛选，使用edge R包绘制差异基因表达热图，筛选HUA差异表达基因，建立HUA特征性表达谱并利用STRING平台（https：//www.string-db.org/）进行蛋白质-蛋白质相互关系（protein-protein interaction，PPI）分析，应用Cytoscape 3.6.1软件对差异基因进行PPI网络可视化分析与数据处理，筛选HUA中的核心基因。将HUA差异基因上传至DAVID数据库中（https：//david.ncifcrf.gov/），并导入关键靶点蛋白，设置P＜0.05进行筛选，对交集靶点进行KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）和 GO（http：//geneontology.org/）富集分析。

1.4 CMAP筛选抗HUA治疗药物 使用Connectivity Map数 据库（https：//cmap.ihmc.us）筛 选抗HUA候选药物，分上调基因和下调基因上传至药物转录组数据库，进行药物表达谱与疾病表达谱数据对比，并采用非参数Kolmogorov-Smirnov方法处理，获得负分值药物，表示对HUA有潜在治疗作用，预测抗HUA药物。

1.5 候选药物与核心靶点蛋白分子对接验证 使用PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载核心基因靶点蛋白的3D结构；
使用Pubchem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载抗HUA活性候选药物的3D结构；
采用chem3D软件转换为mol2文件，选择 Swissdock（http：//www.swissdock.ch/docking）平台进行分子对接，下载对接文件后，采用Chimera1.14软件进行对接文件的可视化与数据分析，记录各对接靶点的Estimated ΔG值。

1.6 抗HUA候选药物的细胞毒性和对HK-2HUA细胞模型的影响 取对数生长期的HK-2细胞，接种于96孔培养板。加入不同浓度的阿维菌素溶液实验组，将细胞培养24 h和48 h后，分别加入CCK-8试剂，37℃孵育1 h后，酶标仪在450 nm处测定吸光度A值，计算细胞活力。取对数生长期的HK-2细胞，接种于96孔板培养24 h，实验设为6个组，阳性药物对照组加入100 μmol/L别嘌醇溶液，样品组分别不同浓度的阿维菌素溶液，37℃培养箱孵育24 h。实验组均用2.5 mmol/L的腺苷孵育30 h后，加入0.005 U/mL的XOD溶液孵育12 h。收集细胞上清液，酶标仪检测细胞上清液中尿酸的含量及XOD活力。

1.7 统计学方法 实验数据使用SPSS 20.0软件处理，F方差检验后，用均数±标准差表示，实验组间差异进行t检验分析，P＜0.05认为差异有统计学意义，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.1 HUA差异表达基因谱的筛选 GEO数据库中，获得基因表达数据GSE160170，并通过RMA算法对矩阵数据归一化，经标准化处理后GSE160170芯片数据集的样本基因表达均衡，（图1A）。以P＜0.01，Fold change＞1.5为截断值，Limma分析拆芯片数据的差异基因，得到下调基因810个，上调基因682个（图1B）。

图1 HUA差异基因分析Fig.1 HUA differential gene analysis

2.2 HUA关键基因的筛选 将差异基因上传至STRING数据库，构建了差异基因的PPI网络（图2A），并在此基础上了构建了核心基因差异基因的PPI网络，应用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析，结果显示，白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、趋化因子配体 2（Chemokine Ligand 2，CXCL2）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等可能是HUA发病中的核心靶点（图2B）。

图2 HUA差异基因的PPI网络分析Fig.2 PPI network analysis of HUA differential genes

2.3 差异表达基因GO和KEGG富集分析 将生物过程、细胞组成和分子功能显著的差异基因绘制成柱状图，GO分析显示，共同差异表达基因参与核小体组装、白细胞趋化性、负调控细胞群增殖等生物过程；
参与核小体、细胞顶端部分、细胞间交流等分子组成；
涉及蛋白质异二聚化活性、趋化因子活性、C-C趋化因子结合等分子功能（图3A）。KEGG共筛选到9条与HUA治疗有关的通路，分析显示这些差异基因主要涉及HDACS去乙酰化组蛋白（HDASC deacetylate histones）、IL-7信号（IL-7）、UB特异性加工蛋白酶（UB-specific processing proteases）等信号通路（图3B）。

图3 HUA差异基因的GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of HUA differential genes

2.4 CMap药物转录组数据库预测HUA治疗药物 通过CMap药物转录组数据库分析：预测435个药物对HUA差异基因进行负调控，选取负调控药物中的前15个药物进行文献调研，有1个为HUA临床使用药物，5个为有明确的文献报道具有降尿酸作用（表1），选择三种评分较高的药物阿维菌素、荜茇酰胺和布地奈德进行体外活性实验验证，荜茇酰胺与布地奈德均无抗HUA活性，阿维菌素在体外模型中具有良好的抑制尿酸生成及抑制XOD酶活性，后续对阿维菌素进行体外抗HUA细胞模型研究。

表1 CMap药物转录组数据库对抗HUA药物的预测Tab.1 Prediction of anti-HUA drugs from the CMap drug transcriptome database

2.5 候选药物与核心靶点蛋白分子对接验证 受体与配体蛋白结合构象越稳定则能量越低，越可能发生相互作用。当结合能绝对值Estimated ΔG大于4.25具有一定活性，大于5.0有较好结合活性，而大于7.0则具有强结合活性。结果发现，阿维菌素与TNF、CXCL2、IL-6和IL-1β的结合能分别为-7.97、-6.25、-6.73、-7.68 kcal/mol，表明阿维菌素与核心靶点蛋白均有良好的结合活性（图4）。

图4 阿维菌素与HUA核心靶蛋白的分子对接Fig.4 Molecular docking of Avermectin with HUA core target protein

2.6 抗HUA候选药物的对HK-2的细胞毒性及对HUA细胞模型的影响 在对候选药物的抗HUA活性验证中发现，在药物浓度为400、200 μg/mL的阿维菌素作用下，对HK-2细胞有较大生长抑制（P＜0.000 1），而在12.5～100 μg/mL范围内对HK-2细胞存活率影响较小（P＞0.05，图5A、B）。与模型组相比，阳性药物别嘌醇（allopurinol，ALLO）组细胞上清液中尿酸浓度明显降低（t=20.44，P＜0.000 1），表明高尿酸细胞模型建立成功，可以用来评价药物降尿酸活性。与模型组相比，25、50和100 μg/mL阿维菌素可使HK-2细胞上清液尿酸浓度显著下调（t=22.04～40.54，P＜0.000 1），且呈浓度依赖性（图5C）。与模型组相比，25、50和100 μg/mL的阿维菌素都能明显抑制HK-2细胞XOD活性（t=1.718～31.26，P＜ 0.000 1，图5D）。

图5 不同浓度阿维菌素对HK-2细胞活力的影响及对HUA模型上清液UA浓度与XOD活性的影响Fig.5 The effect of different concentrations of abamectin on the viability of HK-2 cells and the effect of UA concentration and XOD activity in the supernatant of HUA model

近年来，HUA正在成为一个严重的公共卫生问题［14］，现有的HUA治疗药物均存在明显的不足，因此，开发新型抗HUA药物具有迫切需求［15］。本研究中对HUA的疾病基因表达谱分析获得了1492个差异基因，其中下调基因810个，上调基因682个。通过CMap药物转录组数据库分析预测阿维菌素具有较好的细胞安全性和抑制XOD酶、降低尿酸的作用。基因表达谱技术与药物转录组数据库可以连接“疾病-靶点”与“靶点-药物”之间的信息，有助于精准的挖掘现有药物的特定功效，实现高效药物重定位。如LUO等［16］通过从公共数据库获得缺血性卒中和正常人群的差异基因，通过CMap预测发现木犀草素具有抗缺血性卒中作用，后续动物模型中证实木犀草素可通过抑制MMP-9和激活PI3K/Akt信号通路发挥抗缺血性卒中作用。

本研究在差异基因的PPI网络中预测到IL-1β、TNF、CXCL2、IL-6等可能是HUA发病核心靶点，有研究报道痛风急性发作伴随着促炎细胞因子IL-1β的分泌，血清中尿酸浓度越高，可能引起IL-1β的分泌增加［17］。TNF信号通路是重要的炎症信号通路，信号转导由TNF受体1（TNFR1）和受体2（TNFR2）介导，TNFR2在免疫细胞中表达，它与TNF-α和TNF-β结合来调节免疫反应［18］。TNF-α是一种由不同细胞类型产生的促炎细胞因子，如巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞等，其中细胞中尿酸可提高TNF-α的含量，进而TNF-α可促进刺激IL-1β的分泌［19］。CXCL2拮抗剂可缓解尿酸诱导的心脏肥大并抑制心脏炎症和纤维化，CXCL2可能对预防和治疗尿酸诱导的心脏肥大和炎症反应有效［20］。有研究表明与正常人相比HUA患者血清中IL-1β和IL-6水平显著升高，且具有统计学意义［21］。以上研究显示，IL-1β、TNF、CXCL2、IL-6可能是阿维菌素治疗HUA的关键靶点。KEGG分析显示HUA核心靶点主要涉及HDASC deacetylate histones、IL-7、UB-specific processing proteases等信号通路，通过以上生物信息学分析结果显示，治疗HUA药物可能通过多靶点、多通路作用于HUA。

本研究通过分子对接和HUA细胞模型实验验证发现阿维菌素具有降尿酸作用，阿维菌素是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的大环内酯类抗生素［22］。阿维菌素具有良好的杀虫效果，还具有抗癌［23］、抗病毒［24］、抗真菌［25］等作用。据报道，阿维菌素在剂量为300 μg/kg，阿维菌素与血浆蛋白结合，在肝脏中经过细胞色素P450系统代谢，几乎全部通过粪便排出，由于血脑屏障的限制，在大脑中发现的阿维菌素药物含量最低，因此阿维菌素对大多数哺乳动物物种是安全的［26］。本研究首次发现阿维菌素具有抑制XOD酶活性、降低尿酸的作用，有望成为治疗HUA的候选药物，但阿维菌素抗HUA作用和机制还有待进一步通过动物实验进行验证和深入研究。

综上所述，本文通过HUA疾病基因表达谱和药物转录组数据相结合，连接“靶点-疾病”和“靶点-药物”信息，从老药中筛选出具有抗HUA的潜力药物为阿维菌素，并在体外细胞模型对其抗HUA活性进行了验证。此研究的开展将有助于提高抗HUA药物研发效率，为抗HUA研发提供一种新思路。

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