贵州废弃烟叶抗炎活性部位及其化学成分分析鉴定*

孙佳玉，穆淑珍，李 江，邓璐璐，苏贤坤

(1 贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550000；
2 贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550000；
3 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550000)

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，其参与了多种病理疾病的发生和发展过程，过度的炎症反应会导致多种组织、器官的严重损害，进而诱发疾病的产生，严重者甚至会导致休克或死亡[1-3]。目前临床上主要使用甾体和非甾体两大类抗炎药物治疗炎症性疾病，其治疗效果虽然显著，但它们可能对组织器官和机体造成不可逆的损伤，甚至引起死亡，严重影响着人类和动物的健康[4-5]，目前尚无有效的特效抗炎药物。因此，寻找新型的抗炎候选药物先导化合物依然是当前创新药物研发的重要组成部分。

从药用植物中寻找活性成分是创新药物先导物发现的重要途径之一。烟叶除作为卷烟的重要原料之外，也是很有价值的药用植物，在我国各地广泛种植，其中含有烟碱、茄尼醇、绿原酸等多种有效成分，广泛应用于医药、生物和化学等领域，具有广阔的应用前景和良好的研究价值[6-7]。烟叶属于茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)一年生或有限多年生草本植物烟草(NicotianatabacumL.)，其全株可作农药杀虫剂，亦可药用[8]。烟叶作为一种高产、重要的经济作物，其废弃物的增量也随烟叶产量大幅度增长，但通过文献调研发现国内外对烟叶提取物生物活性主要体现在抗神经系统疾病、抗肿瘤、抗病毒等方面，抗炎方面的研究却鲜见报道[9-12]。因此，本研究旨在研究废弃烟叶提取物不同极性部位的抗炎活性作用及其化学成分分析与鉴定，为进一步高值化、绿色开发多用途的废弃烟叶，研制出具有绿色、毒副作用小的天然抗炎产品提供科学依据。

1.1 仪 器

Dionex Ultimate 3000 RSLC/Thermo Scientific Q Exactive Focus型高分辨质谱仪，3111型二氧化碳细胞培养箱，美国 Thermo Fisher Scientific公司；
EPOCH 型多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司；
离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司；
CX23 型生物显微镜，日本Olympus公司；
HFsafe-1200LC型生物安全柜，上海力新仪器有限公司。

脂多糖，北京索莱宝科技有限公司；
NO 检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；
青霉素链霉素双抗、胎牛血清和DMEM培养基，美国Gibco公司；
细胞培养皿、冻存管、96孔板、细胞培养瓶，美国Corning 公司；
甲醇、乙腈试剂为色谱纯，上海阿达玛斯试剂有限公司；
其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 药材与细胞

烟叶(云烟87)于2021年6月采自贵州省安顺市平坝区鼓楼办事处天马村(贵州省烟草科学研究院提供)。标本存放于贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室。

小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

2.1 烟叶不同萃取部位的制备

将废弃烟叶(1.0 kg)晾晒粉碎后，用95%的工业乙醇提取，提取3次，每次提取3 h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，制得烟叶醇提物浸膏；
将烟叶醇提物(32.8 g)溶解后用 40～80目硅胶拌样装入玻璃柱(36 cm×7.5 cm)中，依次使用不同极性溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇洗脱，将各种不同极性溶剂的滤液分别收集并减压浓缩后，可得到石油醚组(M1)、乙酸乙酯组(M2)、正丁醇组(M3)和甲醇组(M4)等 4种不同极性部位。称取适量上述4种不同极性部位和乙醇提取物(M5)，用DMSO溶液将上述不同极性部位溶解，制得浓度为50 mg/mL的药物母液，分别为石油醚组(M1)、乙酸乙酯组(M2)、正丁醇组(M3)、甲醇组(M4)和乙醇提取物组(M5)，置于4 ℃冰箱中保存，以备后续抗炎活性筛选实验所用。

2.2 细胞培养

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7加入DMEM培养基(含10%胎牛血清及1%的青链霉素双抗)中，于37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养，次日换液[13]。

2.3 抗炎活性筛选

参照文献[14]的方法，利用LPS诱导RAW 264.7 细胞建立炎症模型，以细胞培养基中诱导产生的NO浓度评价烟叶不同极性部位的抗炎活性。取对数生长期的RAW 264.7 细胞，按2×104个/孔接种于96孔板中，于细胞培养箱中培养12 h，弃去上清液，将细胞分为空白对照组、模型组和药物组(乙醇提取物组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组、甲醇组)。模型组加入与药物组DMSO含量相同的溶液，药物组分别加入含相应药物的溶液，每孔100 μL，上述药物的质量浓度(终浓度)分别为25.0、50.0、100.0 μg/mL，每组设置3个复孔。继续培养1 h后，按5 μL/孔加入2 μg/mL的LPS(溶剂为含10% FBS、1%的青霉素和链霉素双抗的DMEM培养基)；
继续培养8 h后，弃去上清液，按NO检测试剂盒说明书进行操作，使用多功能酶标仪于540 nm波长下检测各孔的光密度(optical density，OD)值，配置NaNO2标准品溶液，浓度范围为100～0.31 μM，通过标准曲线法计算出培养基RAW 264.7细胞产生亚硝酸盐的浓度。

2.4 抗炎活性部位化学成分的分析与鉴定

2.4.1 检测方法与条件

(1)液相色谱方法：UHPLC为Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC；
色谱柱为ACE Ultracore 2.5 SuperC18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；
流速为 0.3 mL/min，柱温为40 ℃，进样体积为 5 μL；
流动相：A相为乙腈(含0.1%甲酸)，B相水(含0.1%甲酸)，梯度洗脱条件见表1。(2)质谱方法：质谱仪为Thermo Scientific Q Exactive Focus台式高分辨质谱仪；
实验采用正负切换Full MS-ddMS2扫描方式进行筛查分析，Full MS：分辨率为 70000，isolation width为 1.5 m/z，MS/MS 采集：17500分辨率下数据依赖采集；
碰撞能梯度(NCE 模式)：20、40、60 eV；
质荷比窗口宽度(TopN)：3；
质谱测定数据采用全扫描模式采集，数据采集范围m/z 100～1500。(3)样品前处理：参照文献[15]，抗炎活性部位组经1%甲酸乙腈/水溶液溶解，离心，过滤，供测定分析。

表1 UHPLC检测条件Table 1 UHPLC detection conditions

2.4.2 数据分析

分别精密吸取“2.1”项下抗炎活性检测组中明确为活性部位的供试品溶液，按“2.4.1”项下检测条件进样分析，得总离子流图。根据所得总离子流图，提取化合物精确分子质量信息，运用 Xcalibur 3.0软件(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)在质量偏差小于5 ppm 的范围内计算其可能的元素组成。其次，以一级质谱获取的分子离子峰作为母离子，进行碰撞诱导解离(CID)二级质谱分析，获得相应化合物的碎片离子。

3.1 废弃烟叶乙醇提取物中不同极性部位的抗炎活性

废弃烟叶提取物中不同极性部位在200 μg/mL浓度下对RAW 264.7细胞的细胞毒性结果见图1，由图可见废弃烟叶石油醚组(M1)、乙酸乙酯组(M2)、正丁醇组(M3)、甲醇组(M4)和乙醇提取物(M5)对RAW 264.7 细胞均没有细胞毒性；
上述五组样品对RAW 264.7细胞均显示有抗炎活性，如图2所示，其中乙酸乙酯组(M2)和正丁醇组(M3)的抗炎活性尤为突出。

图1 不同极性部位对RAW 264.7细胞的细胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of different polar parts on RAW 264.7 cells

图2 不同极性部位对RAW 264.7细胞生成NO的影响Fig.2 Effects of different polar parts on NO production in RAW 264.7 cells

3.2 抗炎活性部位的化学成分分析与鉴定结果

烟叶提取物中抗炎活性显著的乙酸乙酯组(M2)和正丁醇组(M3)部位的总离子流图见图3和4。根据所得总离子流图(TIC)，提取化合物精确分子质量信息，与化学成分数据库比对，并结合化合物质谱的碎片离子信息和相关文献报道，最终从乙酸乙酯组中鉴定了 21个化合物，正丁醇组中鉴定了21个化合物，结果见表2和表3。

图3 乙酸乙酯组在正离子和负离子模式下的TIC图Fig.3 TIC of ethyl acetate group in positive and negative ion mode

图4 正丁醇组在正离子和负离子模式下的TIC图Fig.4 TIC of n-butanol group in positive and negative ion mode

表2 乙酸乙酯组化学成分分析与鉴定结果Table 2 Chemical components from ethyl acetate group by analyzing and identifying

表3 正丁醇组化学成分分析与鉴定结果Table 3 Chemical components from n-butanol group by analyzing and identifying

通过对贵州废弃烟叶中乙醇提取物及其不同极性部位进行体外抗炎活性筛选，发现上述不同极性部位对RAW 264.7细胞均有抗炎活性，尤其是乙酸乙酯组和正丁醇组的抗炎活性较为突出，提示了废弃烟叶在抗炎活性方面应该具有较好的研发潜力。进一步运用高分辨质谱技术，结合二级质谱数据、保留时间，与相关数据库和文献进行比对，分别从抗炎活性显著的乙酸乙酯组和正丁醇组中各分析鉴定出21种化学成分。通过文献调研发现其中的(-)-可替宁、东莨菪内酯、松香酸和石吊兰素等单体化合物是具有一定的抗炎活性的，推测乙酸乙酯组和正丁醇组产生的抗炎活性可能与上述具有抗炎活性的化合物有着密切关系。

本研究对贵州废弃烟叶中不同极性部位抗炎活性筛选并采用高分辨质谱Q Exactive Focus分析鉴定了活性部位乙酸乙酯组和正丁醇组中的化学成分。通过调研发现部分化合物有文献报道其具有抗炎活性，其主要成分为萜类和黄酮类化合物，其次为生物碱类和酚类化合物，这为进一步开展废弃烟叶中的活性物质基础研究奠定了基础，同时为废弃烟叶的多用途研究，进而研制出具有毒副作用小的天然抗炎保健品或药物提供了新思路和科学依据。

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