血小板输注无效患者外周血T、B、NK,细胞和血小板抗体表达

张玲 孙庆正 王晓珍 刘加军

血小板输注是指通过补充外源性血小板，从而预防和治疗血小板功能异常或者血小板数量下降引起的出血。血小板输注是目前治疗各种血液病的有效支持治疗［1］。但血小板输注过程中可能会出现血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness，PTR），尤其常见于反复多次输血小板这类患者中，发生率约38.3%至40.9%，患者血小板数量未见提高，出血症状无明显改善［2-4］。本研究拟通过分析血小板输注无效患者外周血中T、B、NK 细胞比例和血小板特异性抗体表达，探讨其在血小板输注无效中的作用。

1.1 研究对象

以2018 年1 月至2021 年12 月中山大学附属第三医院收治的22 例血小板输注无效的患者作为研究对象，其中急性髓系白血病（AML）14 例，急性淋巴细胞白血病（ALL）8 例，男8 例，女14 例，平均年龄（46.09±3.253）岁。以33 例输注有效的患者作为对照组，其中急性髓系白血病（AML）24 例，急性淋巴细胞白血病（ALL）9 例，男18 例，女15 例，平均年龄（43.67±3.24）岁。

纳入标准：①急性髓系白血病或者急性淋巴细胞白血病；
②签署知情同意书。排除标准：①脾功能亢进，抗血小板药物，弥散性血管内凝血（DIC）等引起的血小板输注无效；
②缺失重要诊疗信息的患者。所有患者均签署知情同意书。该研究符合中山大学附属第三医院相关伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 患者外周血T、B、NK 淋巴细胞比例检测

留取EDTA 抗凝管2 mL 外周血，PBS 液洗涤后调整细胞数至（1～10）×109/L；
按比例分别加人CD19、CD3、CD4、CD8、CD56 和CD45 抗体（Becton Dickinson 公司），室温避光孵育20 min；
然后再加入红细胞裂解液，避光孵育10 min，用PBS 液洗涤，离心后弃上清；
加入500 μL PBS 液重悬细胞，上机检测，以CD45-SSC 设门圈出淋巴细胞，计算T 淋巴细胞亚群（CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+）比例，B 淋巴细胞（CD19+），NK 细胞（CD56+）比例。

1.2.2 血小板特异性抗体检测

血小板表面携带有血小板特异性抗原（HPA），通过固相凝集法检测血小板特异性抗体（HPA 抗体），留取EDTA 抗凝管2 mL 外周血，4 000 rpm，离心半径为16.3 cm，离心5 分钟后取上层血浆，冻存至负80 度冰箱待检。按照血小板抗体检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 进行统计学处理。计数资料采用n（%）表示，用χ2检验。计量资料采用（±s）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 血小板特异性抗体表达情况比较

无效组血小板特异性抗体表达阳性率明显高于有效组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 血小板输注患者血小板特异性抗体表达情况［n（%）］Table 1 The expression of platelet specific antibody in patients received platelet transfusion［n（%）］

2.2 流式细胞术检测患者外周血T、B、NK 淋巴细胞比值

与有效组相比较，无效组患者外周血B 细胞升高，CD3+CD4+T 淋巴细胞下降，CD3+CD8+T 淋巴细胞升高，CD4+/CD8+比值下降，CD3+T 淋巴细胞和NK 细胞比例，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1。

图1 血小板输注患者外周血T、B、NK 细胞比例（%）Figure 1 The Proportion of T，B and NK cells in peripheral blood of patients received platelet transfusion（%）

表2 血小板输注患者外周血T、B、NK 细胞比例（%）Table 2 The Proportion of T，B and NK cells in peripheral blood of patients received platelet transfusion（%）

血小板输注是治疗血小板减少的有效手段。在需要长期血小板支持性治疗的患者中，血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness，PTR）是常见的临床棘手问题，其发生时，外源性输入的血小板迅速被破坏，严重时可危及生命。血小板输注无效是指连续两次或者两次以上输注血小板，输注后10 分钟至1 小时，血小板计数增加指数＜5×109/L［5］。

PTR 发生的常见原因包括非免疫因素和免疫因素。非免疫因素主要为机体出现发热、服用抗血小板药物、脾功能亢进、弥散性血管内凝血（DIC）等，导致血小板消耗过多或破坏增加，从而引起血小板输注无效。这些可通过祛除病因和对症治疗来提高血小板输注效果［6］。免疫性因素主要指同种异体免疫，即输注的外源性血小板，作为同种异体抗原，诱发机体的同种异体免疫反应，从而导致血小板输注无效［7-8］。

血小板表面携带人类白细胞抗原（HLA）、血小板特异性抗原（HPA），可产生的HPA 抗体、HLA抗体和HLA/HPA 复合抗体，这些抗体是导致无效输注发生的主要原因［9-12］。在本研究中我们分析了血小板输注无效组和有效组血小板特异性抗体（抗HPA 抗体）的表达，发现无效组血小板特异性抗体阳性率明显高于有效组（86.36% vs 15.15%，P＜0.01），提示血小板特异性抗体在血小板输注无效中发挥重要作用，与研究报道相符［13］。临床上通过检测血小板特异性抗体及输注配型血小板有助于预防血小板输注无效的发生。

血小板输注后引起的同种异体免疫需要启动和激活特异于源自血小板抗原肽的CD4+T 细胞，CD4+T 细胞激活后反过来刺激B 淋巴细胞，B 细胞进一步分化成浆细胞，浆细胞产生免疫球蛋白G（IgG）抗体，这些抗体可结合血小板表面，从而导致血小板输注无效［14］。

目前关于机体产生同种免疫反应的机制尚不清楚。因此，我们分析了血小板输注患者外周血T、B 和NK 细胞比例，以探讨血小板输注无效可能的免疫机制。研究发现，血小板输注无效患者外周血中B 淋巴细胞比例升高，B 淋巴细胞可能进一步分化为浆细胞，产生血小板抗体从而引起血小板输注无效，提示临床上可使用利妥昔单抗提高血小板输注效果。

T 淋巴细胞在机体细胞免疫和体液免疫中发挥重要作用，CD3 仅存在于T 淋巴细胞表面，参与抗原识别和信号转导。T 淋巴细胞亚群分为辅助性T 淋巴细胞和细胞毒性T 淋巴细胞，CD4 为辅助性T 淋巴细胞的主要标记，具有刺激B 淋巴细胞分化为浆细胞，辅助T 淋巴细胞转化成效应细胞。CD8为细胞毒性T 淋巴细胞的主要标记，通过分泌细胞因子参与细胞免疫。本研究通过CD45 设门圈出淋巴细胞，CD3 标记T 淋巴细胞，然后通过CD4，CD8标记CD3+CD4+T 淋巴细胞，CD3+CD8+T 淋巴细胞，分析T 淋巴细胞亚群变化，发现PTR 患者较有效组CD3+CD8+T 细胞比例增高，而CD3+CD4+T 细胞比例减低，提示CD8 阳性T 淋巴细胞在血小板输注无效中发挥重要作用，与研究报道相符［15］。CD4 阳性T 细胞与CD8 阳性T 细胞的比值保持动态平衡，从而维持机体的细胞免疫。本研究发现血小板输注无效患者CD4+/CD8+比值下降，T 淋巴细胞比例失衡，CD8+T 淋巴细胞增高，促进B 细胞活化产生抗体，从而导致血小板输注无效。

NK 细胞称自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，CD56 是NK 细胞的表面标志物。目前关于NK细胞在PTR 中的作用尚不明确，本研究尚未观察到NK 细胞在血小板输注中的差异，可能与本研究样本量偏少有关，未来尚需扩大样本量进一步明确NK细胞在血小板输注无效中的作用及可能的机制。

综上所述，血小板特异性抗体表达，T、B 淋巴细胞异常在血小板输注无效中发挥重要作用，但其具体作用机制尚不明确。进一步探讨血小板输注无效的发生机制，有助于预防和治疗血小板输注无效。

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