肺癌组织环指蛋白181、转移相关基因1、血管内皮生长因子C表达及与患者临床病理特征和预后相关性分析

王华寿，卢陈嘉，黄俊文，林少明

(1.深圳市龙华区人民医院病理科，广东 深圳 518109；
2.深圳市龙华区人民医院呼吸内科，广东 深圳 518109)

肺癌属于临床上最为常见的一种呼吸系统恶性肿瘤，患者普遍预后不良[1-2]。伴随着人们生活方式的日益改变以及生活环境的不断变化，该病发病率呈持续增长趋势，且开始趋于年轻化。据相关不完全统计，直至2025年，我国每年肺癌新增人数将突破100万，成为全球第一大肺癌国家[3]。该病早期无典型表现，绝大多数患者首次确诊便是中晚期，无法从根治性手术中获益。环指蛋白181(Ring finger protein 181，RNF181)广泛表达于肝脏、肾脏以及胰腺等多种组织中，且在多种肿瘤组织中均有表达[4]。转移相关基因1(Metastasis associated gene 1，MTA1)分布在人体多种组织器官中，可通过参与组蛋白乙酰化等过程，间接影响肿瘤发生、发展过程[5]。血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor，VEGF-C)可通过诱导淋巴管内皮细胞的增殖以及迁移等途径，参与肿瘤病理学血管生成[6]。鉴于此，本文通过研究肺癌组织RNF181、MTA1及VEGF-C表达意义及其和病理特征、预后的相关性，以期提供新的靶点为临床肺癌诊治研究提供方向，现报告如下。

1.1 一般资料 选择2019年2月至2021年2月收治的100例肺癌患者。其中男61例，女39例；
年龄33～82岁，平均(58.32±10.56)岁；
肿瘤直径：≤5 cm 67例，>5 cm 33例；
分化程度：低35例，中高65例；
TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期47例，Ⅲ-Ⅳ期53例；
淋巴结转移41例。病例纳入标准：①所有入选对象均经病理检查确诊为肺癌；
②入院前尚未实施抗肿瘤干预；
③年龄≥18周岁；
④具备完整病历。排除标准：①同时并发其他器质性病变者；
②意识模糊或神志异常者；
③研究期间因故退出或失访者。受试者均知情并签署告知书，获得伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 RNF181、MTA1及VEGF-C表达检测：
借助SP法完成上述蛋白的检测。首先取肺组织标本，常规石蜡包埋处理后制备成厚度为4 μm的连续切片。烤片机烘烤60 min之后以二甲苯实施脱蜡处理，并进行梯度酒精脱苯。滴加3%双氧水，放置在室温条件下进行时长10 min的孵育，实现对内源性过氧化物酶的阻断，实施高温高压修复10 min。分别滴加一抗放置在4 ℃条件下孵育过夜，以PBS液重复冲洗3次之后二抗，室温条件下进行15～20 min的孵育处理。然后滴加SP工作液，于室温条件下孵育15～20 min，DAB显色(试剂批号：J190123CF)。

1.2.2 结果判定[1]：所有切片结果均由2名病理科医师采用双盲对照法完成。RNF181及MTA1为细胞核着色，VEGF-C为细胞质着色。所有切片均随机抽选5个视野，以染色强度评分及阳性细胞占比评分乘积作为最终结果。染色强度评分：无色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕黄色3分；
阳性细胞占比评分≤25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。两项评分乘积为最终结果，且将乘积≥3分视作阳性。

1.2.3 分组：
将所有受试者按照生存状况的差异分为死亡组39例及存活组61例。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行处理。计数资料以[例(%)] 表示，用χ2检验；
P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 不同肺组织RNF181、MTA1及VEGF-C表达水平比较 肺癌组织RNF181阳性率为24.00%，低于癌旁正常组织的75.00%，而MTA1、VEGF-C阳性率分别为73.00%、69.00%，高于癌旁正常组织的25.00%、33.00%(均P<0.05)，见表1。

表1 不同肺组织RNF181、MTA1及VEGF-C表达水平比较[例(%)]

2.2 不同病理特征受试者RNF181表达评价比较 低分化、Ⅲ-Ⅳ期与淋巴结转移患者的RNF181表达均低于中高分化、Ⅰ-Ⅱ期与无淋巴结转移者(均P<0.05)，见表2。

表2 不同病理特征受试者RNF181表达评价比较[例(%)]

2.3 不同病理特征受试者MTA1表达评价比较 低分化、Ⅲ-Ⅳ期与淋巴结转移患者的MTA1表达均高于中高分化、Ⅰ-Ⅱ期与无淋巴结转移(均P<0.05)，见表3。

表3 不同病理特征受试者MTA1表达评价比较[例(%)]

2.4 不同病理特征受试者VEGF-C表达评价比较 低分化、Ⅲ-Ⅳ期与淋巴结转移患者的VEGF-C表达均高于中高分化、Ⅰ-Ⅱ期与无淋巴结转移者(均P<0.05)，见表4。

表4 不同病理特征受试者VEGF-C表达评价比较[例(%)]

2.5 不同预后肺癌患者RNF181、MTA1及VEGF-C表达比较 死亡组RNF181表达低于存活组，而MTA1及VEGF-C表达高于存活组(均P<0.05)，见表5。

表5 不同预后肺癌患者RNF181、MTA1及VEGF-C表达比较[例(%)]

肺癌是病死率最高的恶性肿瘤，早期有效治疗是提高生存率、改善预后的关键，但多数患者早期缺乏明显临床表现，以至于肺癌早期诊断率处于较低水平，往往在病变进展到中晚期时就诊，失去了根治性手术的机会，不得不接受维持性放化疗，预后较差[7-8]。而侵袭及转移均是导致该病患者死亡的关键性原因。如何控制肿瘤的转移和侵袭是中晚期肺癌治疗的关键，和多数恶性肿瘤一样，肺癌侵袭、转移是一个相对复杂的过程，受到多种基因以及多分子的共同调控，而明确相关分子生物学机制对于肺癌诊治具有极其重要的意义[9-10]。RNF181主要定位在人染色体2p11.2上，属于环指蛋白超家族成员之一，分子质量为18 kD啊，由153个氨基酸编码716个碱基组成，分子结构具备RING型结构域，可能通过整联蛋白aⅡbβ3或泛素-蛋白酶等途径起到一系列复杂调控作用[11]。研究表明RNF181在胃癌、肝癌、乳腺浸润性导管癌等多种恶性肿瘤中低表达，并与该肿瘤的浸润、转移等生物行为具有相关性[12]。MTA1属于MTA家族成员之一，可通过和组蛋白脱乙酰基酶相结合，进一步介导核小体形成组蛋白去乙酰化复合物的重塑过程，和染色质的结构改变以及和转录调控密切相关[13]。国内学者研究发现MTA1在原发性肝癌患者呈高表达，并通过调节相关信号通路，与肝癌的转移密切相关[14]。VEGF-C为淋巴管生成因子，可通过和VEGFR-2相结合，进一步介导生理性或(和)病理性血管生成过程，和肿瘤血管生成密切相关[15]。赵丽霞等[16]研究发现，肺癌组织中VEGF-C与MTA1阳性表达呈正相关，并认为VEGF-C与MTA1在肿瘤的进展、转移过程可能存在协同作用。由此可见，分析上述三项指标表达和肺癌的关系具有极其重要的意义。

本研究结果发现，肺癌组织RNF181阳性率，低于癌旁正常组织。这提示了肺癌组织RNF181异常低表达，且结果显示其表达和患者分化程度、TNM分期以及淋巴结转移有关。考虑原因，RNF181可实现对泛素化过程和Integrins参与的信号转导联系，进一步参与信号转导调控过程，影响细胞周期的调控、凋亡以及信号转导。RNF181可通过对ERK/MAPK信号通路活性产生一定的抑制作用，进一步对细胞周期相关蛋白(如CyclinD1以及p21等)实施调控，进一步对细胞周期自G1期至S期的进展起到调控作用，最终在肺癌的发生、发展过程中起着关键性作用[17]。此外，MTA1、VEGF-C阳性率高于癌旁正常组织。这反映了肺癌组织MTA1、VEGF-C均存在异常高表达，且结果还显示了上述两项蛋白表达与分化程度、TNM分期以及淋巴结转移有关。究其原因，MTA1基因所编码的相关蛋白羧基末端富含脯氨酸，其相关残基序列可通过和SH3结构域进行配对，继而实现对信号传导通路中的蛋白和蛋白间相互作用的调控，介导了细胞内信号转导以及细胞增殖等过程。另有研究学者发现[18]，该基因存在1个SANT结构域，其和转录因子myb-相关蛋白DNA结合域相似，介导了细胞存活、增殖以及分化调节等过程。VEGF-C是迄今为止人类所发现的唯一特异性促淋巴管生长因子，可通过和VEGFR-2以及VEGFR-3特异性结合，进一步参与淋巴管内皮细胞增殖、迁移以及肿瘤血管生成过程，对肿瘤生长具有促进作用[11]。刘露等[20]的研究发现肺癌组织中MTA1、VEGF-C呈高表达，且与肺癌的恶性程度和淋巴转移密切相关，并认为这两项指标有望成为肺癌侵袭、转移有效的判断指标。另外，死亡组RNF181表达低于存活组，而MTA1及VEGF-C表达高于存活组。提示了上述蛋白异常表达可能与患者预后有关。初步分析认为，可能是随着RNF181表达的下调以及MTA1、VEGF-C表达的上调，患者病情往往加重、恶性程度较高、淋巴结转移风险较高，从而导致患者预后不良。

综上所述，肺癌组织RNF181、MTA1及VEGF-C均存在异常表达，且均和病情严重程度、淋巴结转移与预后密切相关，有望成为辅助评估患者病情以及预后的可靠指标。本研究不足之处在于病例数较少，所得结论尚需扩大样本量进一步验证。另外，RNF181、MTA1、VEGF-C各自或协同对肺癌进展的调控作用及相关分子机制也是本课题进一步研究的方向。

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