新疆部分焉耆马场马梨形虫病病原学检测及序列分析

诺明达来，甘 露，李 丽，刘 燕，呼尔查，3，巴音查汗

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；
2.和静县畜牧兽医站，新疆和静 841300；
3.新疆农业大学兽医学博士后流动站，新疆乌鲁木齐 830052）

马梨形虫病（equine piroplasmosis，EP）是经硬蜱传播，由马泰勒虫（Theileriae-qui，T.equi）和马驽巴贝斯虫（Babesia caballi，B.caballi）寄生于马属动物红细胞内引发一系列临床症状的血液原虫病，其主要临床特征是急性溶血、高热、呼吸困难和黄疸，急性感染时，易造成感染马匹死亡[1-4]。

EP 流行的恶性循环由“马匹-媒介蜱虫-梨形虫”等三要素构成[5]。硬蜱是本病传播媒介，对该病流行起着至关重要的作用[6]。据报道[7]，共有3 属17 种媒介蜱可传播此病，其中在我国可以传播EP 的媒介蜱包括草原革蜱（Dermacentor nuttalli）、银盾革蜱（Dermacentor niveus）、中华革蜱（Dermacentor sinicus）、边缘革蜱（Dermacentor marginatus）等。由于新疆传播EP 的媒介蜱银盾革蜱和边缘革蜱数量多、分布广，马匹存栏数居我国之首[8]，马匹又以自然放牧为主，非常适于该病传播，因此该病在新疆发生率较高，且呈逐年上升趋势，对新疆马产业发展影响极大[9]。

焉耆马是新疆特色品种，主要饲养于巴音郭楞蒙古自治州的和静、和硕、焉耆县等地。该品种马匹的存栏量因多种原因在逐年减少，其中马梨形虫病是重要因素之一。为了解新疆地区焉耆马场马梨形虫病流行情况，通过设计特异性引物进行PCR 扩增的方法，2022 年在蜱虫活跃季节（3—5月）对和静县某乡村5 个焉耆马场（1～5 号）采集全血样品进行EP 病原DNA 检测，以获得该地焉耆马EP 流行资料，为制定有效的EP 防治措施提供数据支撑。

1.1 材料

1.1.1 样品来源 从新疆和静县1～5 号焉耆马场，以随机抽样方式分别采集56、39、14、10、37 份，共156 份全血样品置于EDTA 抗凝管中。其中，2～4、5～12、13～18 岁年龄段马匹分别采集血液样品12、105、39 份，公马、母马分别采集96、60 份。将全血样品带回实验室，-20 ℃保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 主要试剂：琼脂糖、溴化乙锭，购自Sigma 公司；
赛百盛血液基因组DNA 提取试剂盒、AxyGEN DNA 凝胶回收试剂盒，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
DL 2 000 DNA Marker、2×EsTaqMaster Mix，购自晶美有限公司。主要仪器：RADILAD20 台式高速离心机，西班牙ORTOALRESA 公司生产；
DK-600A 型电热恒温水浴锅，上海恒温科学仪器有限公司生产；
DYY-III-5 型电泳仪，北京六一公司生产；
PCR 仪，美国Bio-Rad 公司生产。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及PCR 扩增 从EDTA 抗凝管中吸出200 μL 新鲜血液，加入Proteinase K 混匀，后续操作按照血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒步骤进行。马泰勒虫、马驽巴贝斯虫18S rRNA 特异性引物扩增，分别参照Kumar 等[10]、罗金等[11]提供的方法，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。PCR 反应体系：2×EcoTaqPCR Super Mix 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 补足至13.0 μL。马泰勒虫反应条件：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环。马驽巴贝斯虫反应条件：除56 ℃ 退火45 s 外，其他条件与马泰勒虫反应条件一致。PCR扩增结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像仪中拍照观察。

表1 引物名称及片段大小

1.2.2 克隆载体构建及测序 将PCR 扩增出现与目的片段一致的条带，按照AxyGEN DNA 凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段，胶回收产物与pMD19-T 载体连接。连接体系为10 μL：pMD19-T载体1 μL、PCR 产物4 μL、solutionI 5 μL。冰浴30 min 后，再加入感受态细胞50 μL，热激42 ℃、45 s，冰浴2 min，加入无抗性液体培养基900 μL，摇1 h；
出现絮状物后，10 000 r/min 离心4 min，弃掉850 μL上清，将剩余的150 μL吹打混匀，并把液体加入到含氨苄青霉素的普通固体培养基上涂布均匀，放入37 ℃恒温箱，前30 min 正放，后倒放过夜；
至普通固体培养基上长出单菌落时进行菌液PCR 检测，将出现阳性条带的进行保菌，保存至-80 ℃，然后送上海生工生物科技有限公司测序。

1.2.3 数据分析 使用SPSS Statistics 17.0 软件分析血源性马梨形虫病病原不同地区、年龄、性别的分布差异，测序结果使用NCBI BLAST 进行在线比对后，利用Megalign 与Mega11.0 生物学软件中的邻接法（NJ）进行同源性比较及遗传进化树构建。分析模型为Tamura 3-parameter，进行1 000次自主复制，以确定模型的稳定性，最终获得系统发育进化树。

2.1 马梨形虫病病原PCR 检测

2.1.1 马泰勒虫PCR 扩增 以18S rRNA 作为靶基因进行PCR扩增，经12 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，结果在431 bp 处出现目的条带，条带大小与预期片段大小一致。

图1 马泰勒虫PCR 扩增结果

2.1.2 马驽巴贝斯虫PCR 扩增 以BC-18S rRNA作为靶基因进行PCR 扩增，经12 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析，结果在452 bp 处出现目的条带，条带大小与预期片段大小一致。

图2 马驽巴贝斯虫PCR 扩增结果

2.2 三间分布分析

2.2.1 不同马场 不同马场的统计结果（表2）显示，5 个马场的马泰勒虫总感染率为33.3%（52/156），马驽巴贝斯虫感染率为26.9%（42/156），两者混合感染率为7.7%（12/156）。经SPSS 17.0软件分析，不同马场的EP 病原感染率无显著差异（P＞0.05），95%CI 为1.7%～88.0%。

表2 5 个焉耆马场EP 病原感染情况

2.2.2 不同年龄马匹 不同年龄马匹的统计结果（表3）显示，各年龄段马匹均有EP 病原感染，其中13～18 岁马匹马泰勒虫感染率最高，2～4 岁马匹马驽巴贝斯虫感染率最高。经SPSS 17.0 分析，不同年龄段马匹EP 病原感染率无显著差异（P＞0.05），95%CI 为2.5%～72.7%。

表3 不同年龄焉耆马场EP 病原感染情况

2.2.3 不同性别马匹 不同性别马匹统计结果（表4）显示，公马和母马均有EP 病原感染，其中母马感染率比公马略高。经SPSS17.0 分析，不同性别马匹EP 病原感染率无显著差异（P＞0.05），95%CI 为4.3%～38.9%。

表4 不同性别焉耆马场EP 病原感染情况

2.3 病原核酸同源性比较及系统进化树构建

2.3.1 核酸同源性比较 经同源性比较，测序得到的马泰勒虫18S rRNA 基因序列与参考虫株同源性为95.5%～100%（图3），测序得到的马驽巴贝斯虫BC-18S rRNA 基因序列与参考虫株同源性为98.6%～99.6%（图4）。

图3 马泰勒虫18S rRNA 基因同源性比对结果

图4 马驽巴贝斯虫BC-18S rRNA 基因同源性比对结果

2.3.2 系统进化树构建 构建的系统进化树显示，马泰勒虫18S rRNA 基因与马泰勒虫伊犁株（OL589505.1）位于同一分支上，进化关系较近，与其他地区马泰勒虫株进化关系较远（图5）。马驽巴贝斯虫BC-18S rRNA 与马驽巴贝斯虫新疆株（MT563457.1）聚于同一分支，进化关系较近，与其他地区马驽巴贝斯虫株关系较远（图6）。

图5 马泰勒虫系统进化树

图6 马驽巴贝斯虫系统进化树

EP 流行与马匹自身免疫力、蜱带虫率以及环境密切相关，特别是携带EP 病原的硬蜱对该病传播起着至关重要的作用，蜱虫数量越多其携带EP病原的概率就越高[12]。EP 必须通过硬蜱传播，而硬蜱主要在4—5 月活动，因此本病的流行具有一定的季节性[13]。研究[14]发现，EP 主要集中发生于2—6 月和9—11 月两个时间段，3—6 月为高发期，其中4—5 月为高峰期。而本次样品采集时间在3—5 月，主要在5 月份，处于媒介蜱虫活动高发期，故EP 发生率较高。

本次检测从新疆5 个焉耆马场检出EP 病原核酸阳性82 份，总感染率为52.6%（82/156），其中马泰勒虫感染率为33.3%，马驽巴贝斯虫感染率为26.9%，两者混合感染率为7.7%。新疆这5 个马场的马泰勒虫感染率高于同地区散养户焉耆马阳性率（14.7%），而马驽巴贝斯虫感染率低于同地区散养户焉耆马阳性率（58.8%），这可能与圈养、散养的管理模式、饲养方式有一定的联系[15]。新疆这5 个马场的马驽巴贝斯虫感染率稍低于伊犁昭苏地区的27.23%，马泰勒虫感染率略高于伊犁昭苏地区的19.25%，这可能与气候条件、饲养管理、预防措施等有关[16]。

综上所述，新疆地区EP 流行较严重，因此要高度重视该病预防。首先要改变饲养方式，由自然放牧改为轮牧饲养，以减少马匹与媒介蜱接触的概率；
其次要消灭媒介蜱，定期进行季节性驱蜱，使用驱蜱剂对马匹进行药物预防，以降低媒介蜱数量，阻断病原传播途径；
最后要加强对马匹的EP 病原检测及监控，随时反馈和分析数据，及时调整EP预防控制策略。

本研究选取新疆5 个焉耆马场作为试验点，调查马梨形虫病病原感染情况。通过测序比对发现，马泰勒虫、马驽巴贝斯虫与各自参考虫株的基因序列同源性分别为95.5%～100%、98.6%～99.6%；
进化分析发现，马泰勒虫18S rRNA 基因与马泰勒虫伊犁株（OL589505.1）位于同一分支上，进化关系较近，与其他地区马泰勒虫株进化关系较远。马驽巴贝斯虫BC-18S rRNA 与马驽巴贝斯虫新疆株（MT563457.1）聚于同一分支，进化关系较近，与其他地区马驽巴贝斯虫株关系较远。由此表明，本地焉耆马场的EP 主要通过当地蜱叮咬传播。本研究为地方蜱及蜱传马梨形虫病防控提供了数据支持。

本研究发现：新疆地区焉耆马场普遍存在不同程度的EP 病原感染，感染虫株与本地虫株进化关系最近，表明本地焉耆马场EP 主要通过当地蜱叮咬传播。因此，要高度重视该病预防，将马匹由自然放牧改为轮牧饲养，定期进行季节性驱蜱，同时加强EP 监测，及时调整预防控制策略。

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