核酸依赖性扩增技术研究现状及展望

李锦澎 综述,吴 蓉 审校

1.上海中医药大学附属普陀医院检验科,上海 200062；
2.上海市普陀区中心医院检验科,上海 200062

核酸扩增技术常常用于一些基因鉴定、亲子鉴定、病原微生物学等的检测。基于聚合酶链式反应(PCR)原理而开发出来的各式各样的核酸扩增技术已被广泛使用，如普通PCR、荧光定量PCR等。PCR技术虽然具备特异度高、灵敏度强的特点，但是因其实验操作繁杂、对环境设备要求较高、实验时间长等缺点，其应用范围(如地方医疗、即时医疗等)受到一定的限制，而等温核酸扩增技术则应运而生。自1990年以来，已经开发了十多种等温核酸扩增技术以求替代PCR技术，如环介导的等温核酸扩增技术、核酸依赖性扩增(NASBA)技术、链置换扩增技术、单引物等温扩增技术等。这些技术各具特点且无需繁杂操作步骤与要求严格的设备和环境，只需5～120 min的时间和适合的水浴温度，就能实现核酸的快速扩增并用于后续的检测。因此，快速了解等温扩增技术的近年研究进展，对技术的进一步研究具有重要的科学研究意义。本文就等温扩增技术中NASBA技术近五年来的技术研究及改良进行概述。

1.1基本原理 NASBA技术利用AMV逆转录酶、核糖核酸水解酶H、T7 RNA聚合酶三种酶在41 ℃恒温环境下15～25 min，经过约20个扩增循环，便能实现对RNA模板的109倍扩增[1]。NASBA技术原理如图1所示。如今，NASBA技术已经用于支原体、病毒、细菌等病原体和寄生虫的检测之中[2]。

图1 NASBA原理图

1.2扩增产物检测方法 NASBA核酸扩增后的检测手段众多：电泳分析、化学发光、电化学发光法、酶联免疫吸附试验(MB)技术及其与CRISPR/Cas系统、数字化芯片、脱氧核酶、分裂探针等技术的联合应用。

1.3NASBA技术特点 优点：(1)特异度高、灵敏度强检测所需的RNA水平可低至aM水平。

(2)操作步骤简易，可直接加入没有经提取的RNA标本进行扩增；
采用“一锅法”扩增后可直接读取结果。

(3)设备环境要求低不需要昂贵的PCR仪，只需要一台恒温设备，甚至只是一个水浴锅。

(4)满足世界卫生组织(WHO)的“ASSURED”要求[3]。

缺点：(1)假阳性问题，因非特异性扩增、NTPs等因素而造成假阳性问题。(2)涉及多种酶类，考虑核酸扩增环境对酶活性的影响因素众多。(3)模板RNA易降解，需要加入RNA酶抑制剂保护模板及扩增产物。

2.1NASBA在植物疾病中的应用 早在1998年，MB与NASBA技术的结合运用就被LEONE等[4]提出并应用于马铃薯卷叶病毒的检测中。加入限制性核酸内切酶和运用算法软件，便能实现对肝炎病毒B型、疱疹病毒1型和2型进行定量检测[5]。最近，HEO等[6]使用基于 MB的实时定量核酸依赖性扩增技术(qNASBA)检测苹果锈果类病毒RNA，表明qNASBA技术与建立的RT-PCR技术相比具有更高的灵敏度和特异度。

2.2NASBA在食品安全中的应用 NASBA技术在1995年已被运用在食物空肠弯曲菌的检测之中[7]。ZHAI等[8]运用基因组学技术和NASBA筛选并检测食物中丙型副伤寒沙门菌的特异性血清型标志物，成功地与伤寒沙门菌和甲型副沙门菌区别开来。ZHAI等[9]设计靶向xcd基因的qNASBA检测48种沙门菌和18种非沙门菌，并于活细胞检测背景进行检测，如猪肉、牛头和鲜奶等，同样具有高特异度和达10 CFU/25(g·mL)的检测限。

2.3NASBA在人类疾病中的应用 TENG等[10]通过固化于聚乙二醇的MB捕获聚苯乙烯微球上的扩增核酸产物，应用于流行性感冒病毒A型、流行性感冒病毒B型和呼吸道合胞病毒的检测而无交叉反应。RAMEZANI等[11]利用NASBA联合ELISA快速检测结核分枝杆菌EF-Tu mRNA。在4 h内，最低可以检测到17.5 pg的RNA。对于临床标本，其灵敏度和特异度可达97%和75%。LOENS等[12]对215个咽拭子标本进行衣原体、支原体的检测，qNASBA的结果与qRT-PCR具有较高的一致性。HUANG等[13]对6篇利用NASBA技术检测肺炎支原体的文献进行荟萃分析，总体上发现NASBA技术检测肺炎支原体的特异度和灵敏度分别为98%和77%，集成ROC曲线下面积达0.987 5，表明NASBA技术具有较高的诊断价值。已有多份临床研究使用qNASBA检测HPV、疟原虫的Pfs25 mRNA和疟原虫特异性18s rRNA，结果表明与RT-PCR具有较高的一致性[14-16]。

3.1对核酸扩增反应的改良

3.1.1对扩增效能的优化 传统的NASBA技术依赖于T7 RNA聚合酶合成(-)RNA单链，是核酸扩增反应中的一大限速步骤。因此，2021年JU等[17]在传统NASBA技术的基础上加入切口核酸内切酶(NE)，称为基于切口的指数型链式反应系统的核酸扩增(NESBA)。NESBA检测的合成RNA浓度达1 aM至1 pM，20～30 min即达荧光阈值，检测灵敏度要比传统的NASBA技术高100倍且在检测呼吸道合胞病毒和流感病毒等均未出现假阳性反应。JU等[18]利用NESBA技术30 min内完成检测新型冠状病毒包膜基因(E genes)和核衣壳蛋白基因(N genes)，以其超高的灵敏度可检测低至每反应管10 copy，与RT-PCR相比达到100%特异度和100%灵敏度。

WANG等[19]研究HIV-1时联合了MB和数字化芯片平台技术，并对用于dLAMP和dRT-PCR的微流控芯片进行管道改进，称为数字化核酸依赖性扩增技术(dNASBA)。dNASBA技术可检测达1拷贝/微升的模板量，其灵敏度比普通qNASBA要高一个数量级，因其高特异性与灵敏度、低成本和高效而更加适用于即时诊断(POC)。

借鉴于巢式PCR，ABDOLAHZADEH等[20]首次设计巢式NASBA引物和加入可编码RNA Mango 适配子序列的内向引物，构建巢式NASBA(NMN)检测大肠杆菌ClpB基因，可使NASBA的LOD提高至1.5个RNA分子/微升，即aM水平。相比于没有巢式引物的NASBA，其灵敏度提高了6个数量级。

3.1.2对非特异性扩增反应的优化 假阳性结果一直是NASBA应用的一大痛处。因此，AUFDEMBRINK等[21]用多色的、基于核酸适配子识别的荧光探针，独创性地加入没有靶基因片段、T7 RNA聚合酶启动子序列和适配子编码序列的40 bp干扰核苷酸片段，称为Apta-NASBA，并用于检测产毒素大肠杆菌estP和estH RNA，有效地抑制了传统NASBA非特异性核酸扩增带来的假阳性反应。

3.2对扩增产物检测系统的改良

3.2.1探针的应用及优化 适配子(又称适体)的强特异性和强亲和力特性给予了分裂探针检测扩增产物的应用基础[22]。KIKUCHI等[23]首先利用dapoxyl DNA适配子(DAP-10)设计了一对分裂杂交寡核苷酸适配子探针(SDA)，检测经过NASBA技术扩增寨卡病毒的Z-147基因，LOD值可达10 nM水平。

脱氧核酶(DNAzyme)是一段由脱氧核糖核酸构成的寡核苷酸链，其能形成一定的空间构象而发挥功能。DNAzyme的稳定性和其功能一定程度上给予了分裂探针的应用基础。REED等[24]设计了基于磷酸二酯酶脱氧核酶的分裂探针(sDz)和加入酶底物显色，将NASBA扩增后的寨卡病毒RNA结果可视化，且可于30 min内判断结果，不与登革热病毒和西尼罗病毒产生交叉反应，其最低可检测到2.5 nM扩增产物或(0.4～8.0)×106copy/mL。DHAR等[25]利用基于磷酸二酯酶脱氧核酶的分裂探针(sDz)检测结核分枝杆菌16s RNA，并成功地检测到katG基因的单核苷酸突变，其LOD值达(1.5～13.0)nM。CONNELLY等[26]使用DAP-10-42设计一对分裂杂交寡核苷酸适配子探针，检测耐异烟肼的、单核苷酸突变的结核分枝杆菌katG基因。相比于DAP-10，DAP-10-42可结合多种荧光染料，未来有望应用于多色比对检测平台中。应用免疫学方法半抗原标记探针，构建ELISA方法检测NASBA产物。ASTATKE等[27]首先提出NASBA技术结合ELISA夹心法，加入半抗原标记DNA探针分别检测埃博拉病毒L基因和登革热病毒，同时表明地高辛(DIG)标记相比于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的DNA探针具有更高的信噪比，其LOD值达到10拷贝数/反应管，达到qNASBA检测限水平。

针对Taqman探针荧光基团和淬灭基团的分离与信号获得，CRISPR/Cas系统也得以应用。XUE等[28]构建了基于CRISPR/Cas13“疯切”作用的NASBA (cNASBA)技术检测引起小鼠肠炎的沙门菌16s RNA，判断沙门菌在肠道的分布及qPCR无法检测的活菌数目。

3.2.2核糖开关的应用及改良 生物核糖开关最开始发现于细菌的基因表达调控机制中，如今逐渐应用为基因表达检测系统[29]。CAO等[30]利用基于RNA的生物核糖开关调节β-半乳糖苷酶的表达，以酶底物显色经NASBA扩增后呼吸道合胞病毒A型和B型，最低可检测91 aM的扩增产物，并且与人类冠状病毒HKU1和新冠病毒无交叉反应。WU等[31]在此基础上使用免疫磁珠富集法和滤纸作为冻干剂与载体，可检测低至270 zM诺如病毒的临床标本。

3.2.3固相载体的应用及优化 此前，应用于NASBA的检测系统多为液相之中，而应用固相中的检测系统非常少，最常见的固相载体是横向流动试纸条。最近，MA等[32]提出固相化核酸依赖性等温扩增(SP-NASBA)技术概念，并应用于检测金黄色葡萄球菌金黄色亚种(ATCC 12600) 的rRNA，验证其特异度和灵敏度，同时针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sau3A-I基因，对其进行定量检测。TAKAHASHI等[33]详细描述了利用基于纸的无细胞检测系统快速检测人肠道菌标志物的方法。YRAD等[34]应用横向流动(LF)试纸条检测经NASBA扩增的登革热病毒RNA，其最低判定值可达0.01 μM或1.2 × 104pfu/mL且不受寨卡病毒的干扰。

3.3对扩增副产物检测系统的改良 核酸扩增的副产物有氢离子和无机焦磷酸两种。

应用酸碱指示剂检测反应溶液中的pH变化的检测方法对溶液初始酸碱度有较严格的要求，且受限制的指示剂加入量又会降低溶液颜色变化的显著程度，导致较高的假阴性率，方法的应用和改良空间有限[35]。

最近的研究则多数是针对无机焦磷酸副产物为切入点。ISOBE等[36]使用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPT)、黄嘌呤氧化酶(XOD)和铁测定Nitroso-PSAP法作为检测系统检测经NASBA扩增的人真皮成纤维母细胞β-actin RNA，其构建的检测方法的 LOD和定量限( LOQ)远低于NASBA所产生的焦磷酸浓度，证实了构建的方法的可行度、灵敏度和特异度。相比于已建立的、无酶的焦磷酸检测试剂盒，此构建的基于HPT等酶的焦磷酸检测方法不会出现因NTPs等因素影响而造成的假阳性结果，并且也可用于PCR的产物检测。因ATP存在于各种组织中而不适用基于ATP的酶-底物显色系统，KARASAWA等[37]利用丙酮酸磷酸双激酶和丙酮酸脱氢酶构建化学发光焦磷酸盐检测系统，检测经NASBA扩增的胰腺癌标志物MiR-196a。

核酸扩增技术尚存在许多问题亟待解决，如低拷贝分析物的分析灵敏度问题、反应体系酶类温度控制问题等。其中，最突出的问题是假阳性扩增反应。对于NASBA的非特异性扩增反应，MU等[38]指出可能是因高浓度Mg2+诱导的T7 RNA聚合酶的自发性转录。AMV-RT通过蛋白质间相互作用抑制T7 RNA聚合酶活性的问题也有待解决。NASBA扩增产物检测使用的核酸适配子探针相比于传统的核苷酸探针具有更高的特异性和亲和性，但目前的核酸适配子探针设计软件(如G-Quadruplexes等)算法还有待改进，特别是对于环境离子变化所带来的核酸结构改变的识别和预测仍需要提高[39]。

NASBA技术不仅继承了PCR技术高灵敏度、高特异度的特点，而且具备实验操作简易、流程时长短、不需要特定仪器等特点，已报道应用于有害藻类的环境检测中[40]。基于纸的无细胞检测系统与NASBA的联合运用则更加适用于地方性、偏远地区医疗的即时诊断。从提出到如今，NASBA及其衍生技术不断向着缩短扩增时间、提高特异度和灵敏度、简化结果读取等方向发展。基于多重微阵列技术的检测、即时诊断、食物安全、环境检测和单核苷酸突变分子诊断等领域更凸显了NASBA技术与其他技术联合应用的重要性，其在未来的研究与应用值得深究。

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