后抗生素时代的辅助抗菌策略研究进展

刘畅，沈瀚

南京大学医学院 附属鼓楼医院，江苏 南京 210008

抗生素是人类医学史上最伟大的成就之一，其广泛应用曾一度使人类暂时摆脱了感染性疾病的威胁，开创了人类抗感染治疗的新纪元。然而，抗生素的大量使用导致多重耐药细菌比例正呈现逐年上升态势，新型细菌耐药机制正不断涌现，严重危害了患者的生命健康安全。更为严峻的是，传统抗生素研究自上世纪60年代以来已进入瓶颈期，新型抗菌药物的研发进度已经逐渐落后，人类正被迫走向“后抗生素时代”。在这一背景下，能够与传统抗生素相结合、通过多种方式提高抗感染治疗效率的辅助抗菌策略成为最近几年的研究热点。

细菌外膜位于革兰阴性菌肽聚糖层外侧，对于通过物质的分子大小、电荷、空间位阻具有选择性，是细菌抵抗抗菌药物的第一道防线。不仅如此，研究还表明细菌外膜的物理强度也远超于传统认知，在细菌肽聚糖层受损时能够承担一部分结构支撑作用[1]。细菌在外膜受损时生存能力较差，Tran等发现在使用多粘菌素破坏细菌外膜后，抗肿瘤药物米托坦（mitotane）获得了十分显著的抗菌能力，即使对于多粘菌素耐药菌株也具有较好的疗效。该现象出现的原因目前仍有待探讨，研究认为可能与米托坦在细菌外膜受损后大量进入细菌内部有关[2]。尽管目前米托坦的抗菌机制尚不清楚，但由于多粘菌素-米托坦这一用药组合明显区别于临床常用抗菌药物，细菌尚未获得相应的耐药能力，因此在使用这一方案应对临床多重耐药细菌时能够取得较为理想的治疗效果[2]。以多粘菌素为代表的阳离子抗菌多肽对于细菌外膜具有破坏作用，是传统抗菌药物的理想“扩增器”。多粘菌素衍生物SPR741不仅在体外实验中能够有效降低多重耐药大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌的治疗难度，在体内实验中也能够显著提高受感染实验动物的生存率，目前已进入Ⅰ期临床试验，其临床应用价值未来可期。

外排泵是能够将细菌胞内药物或毒性物质排出胞外的蛋白转运系统，是细菌在抗生素压力下维持生存的重要机制之一。目前已知的细菌外排泵系统可根据氨基酸序列和底物类型分为5个超家族，它们分别是ATP结合盒超家族（ATP-inding cassette superfamily，ABC）、主要促进剂超家族（major facilitator superfamily，MFS）、耐药结节化细胞分化家族（resistance nodulation division family，RND）、小多重耐药转运分子家族（small multidrug resistance family，SMR）和多药及毒性化合物外排分子家族（multiantimicrobial and toxic compound extrusion，MATE），其中以 RND 家族在多重耐药细菌中的分布最为广泛。

使用外排泵抑制剂降低多重耐药细菌耐药性的相关研究已较为深入，羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP）属于外排泵能量阻断剂，可在穿过细菌磷脂双层后解离并释放质子，通过破坏细菌的跨膜电化学梯度降低细菌外排泵活性[3]；
苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺（phenylalanyl-arginyl-β-naphthylamide，PAβN）通过竞争抑制细菌外排泵活性显著提高革兰阴性菌外膜通透性，与喹诺酮类抗生素联用时能够有效降低铜绿假单胞菌的治疗难度[4,5]；
部分喹啉衍生物（quinoline）被证明对于产气肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌外排泵活性具有抑制作用，研究认为其作用机理可能与其在该菌AcrAB-TolC外排泵洞穴结构中形成空间位阻，从而干扰底物的运输过程有关[6-9]。此外，许多天然植物成分也具有明显的细菌外排泵抑制活性，可以协同增强抗生素的抗菌作用[10-11]。然而，由于受到稳定性、安全性、特异性、药代动力学特征等问题的限制，现有外排泵抑制剂在有效剂量下通常表现出较高的细胞毒性，目前尚没有成熟的外排泵抑制剂能够投入临床使用，外排泵抑制剂的相关研究仍有待深入[12-14]。

细菌群体感应（quorum sensing，QS）系统是一类细菌通过分泌自诱导物（autoinducers，AIs）与环境中其他细菌进行通讯，从而特异性调节部分细菌生理学功能的调控系统，已被证明广泛参与细菌的生物发光[15]、生物膜形成[16]、毒素释放[17]、运动性[18]以及芽孢形成[19]等过程，是影响细菌多种生命活动的重要调节机制之一，因此也是新型辅助抗菌药物研发的理想作用靶点。

目前已知的细菌QS系统包括LasI/LasR系统、RhlI/RhlR系统，以及铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统（Pseudomonasquinolone signal，PQS）等，其中前两者属于LuxI/LuxR型，在革兰阴性菌中的分布最为广泛[20]。LasI/LasR系统一般依靠细菌自身合成的3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯（3-O-C12-HSL）或丁基高丝氨酸内酯（C4-HSL）作为AI，并在环境中AI达到阈值浓度时刺激转录激活因子LasR合成AI受体，从而直接或间接完成细菌基因表达水平调控过程。基于此原理，有研究对3-OC12-HSL的五元内酯环和酰胺侧链进行化学修饰，从而达到竞争抑制LasR受体，阻断信号传递的目的[21]；
Colleen等发现溴化硫代内酯（meta-bromo-thiolactone）因其结构与3-OXO-C12-HSL相似而能够同时阻断铜绿假单胞菌的LasR和RhlR系统，导致细菌毒性下降[16]；
黄酮类化合物可利用其结构中A环主链中的2个羟基有效抑制铜绿假单胞菌LasR/RhlR系统的活性，生物化学分析表明黄酮类化合物非竞争抑制LasR/RhlR系统与DNA的结合，从而抑制细菌毒力因子的产生[22]。此外，部分传统药物也被证明对细菌QS具有一定的干扰作用。布洛芬能够有效抑制细菌的QS系统[23]；
阿奇霉素可通过干扰QS系统降低铜绿假单胞菌毒素的产生[24]；
氨溴索通过干扰QS系统抑制细菌生物膜生成[25]；
阿司匹林可作为LasR的竞争性抑制剂显著降低实验菌株的毒素产量和生物膜形成速度[26]。

细菌QS系统种类繁多，不仅一种细菌可同时编码多个QS系统，并且许多细菌常具有自己独特的QS系统，极大地增加了广谱QS抑制剂的研发难度。即使是部分已知的QS抑制剂，其有效成分、作用靶点、作用机制等关键问题也尚未完全清楚，距离成功研发QS抑制剂并将其广泛应用于临床仍有很长的路要走。

进入宿主体内后，细菌首先须借助自身的运动与黏附能力定植于特定的组织/细胞表面，为后续的感染和增殖提供条件。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的鞭毛结构须由FlaA和FlaB蛋白在九碳糖pseudaminic acid（Pse）的O-连接糖基化修饰作用下才能够正常组装并发挥运动功能，而Pse的生物合成先后需要 PseB、PseC、PseH、PseG、PseI和 PseF的参与才能完成[27]。Menard等通过高通量筛选与计算机模拟相结合的方式对Pse合成抑制剂进行筛选，发现CD24868、CD26839和CD36508等3种小分子物质对于Pse的合成具有剂量依赖性的抑制作用，从而有望降低细菌的生存能力，及时被宿主的免疫系统清除[28]。

在革兰阳性菌中，部分细菌黏附因子在锚定于细菌表面肽聚糖层的过程中须借助于分选酶A（sortase A，SrtA）的转肽酶活性，干扰SrtA活性可显著降低细菌感染能力，使得SrtA成为一种极具潜力的新型药物作用靶点[29]。槲皮苷（quercitrin，QEN）是一种来自香柏等中草药的生物类黄酮化合物，具有抗炎作用，早期研究发现其对系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化等具有一定疗效[30-31]，Liu等发现QEN在体外实验条件下可以有效抑制金黄色葡萄球菌SrtA重组蛋白的活性，细菌在QEN的作用下对于纤维蛋白原和纤连蛋白的黏附作用大幅下降[32]。不仅如此，QEN还能通过影响细菌唾液酸代谢途径，降低肺炎链球菌的生物膜形成能力，其在体内实验中的效果仍有待证实[32]。

细菌毒力因子（virulence factors，VF）的生成/释放效率与感染类疾病发生的严重程度密切相关，应用VF抑制剂不仅能够精准降低细菌致病能力、提高患者生生存率，并且由于该类药物不直接抑制细菌生长、细菌生存压力小，因此更不易于诱导细菌耐药性的产生，是一种较为理想的辅助抗菌手段（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）[33]。

Clp蛋白酶家族广泛参与金黄色葡萄球菌毒力基因表达、细胞壁合成、细胞分裂等过程，是控制金黄色葡萄球菌VF表达水平的重要影响因素。Gao等通过gfp-luxABCDE双报告质粒和金黄色葡萄球菌毒力相关基因的多重启动子报告平台筛选毒力蛋白小分子抑制物，最终从化学物质文库中筛选到能够将高致病金黄色葡萄球菌逆转为非致病菌株的小分子化合物M21。M21以非竞争方式抑制ClpP活性并间接导致细菌α毒素的表达水平下降，在小鼠感染模型试验中亦能够有效减弱受试菌株的毒力，提示该化合物体内抑制活性良好，具有较高的临床研究价值[34]。

干扰细菌VF的释放过程同样具有价值。Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion systems，T3SS）由多个蛋白组合而成，其针状结构能够将细菌VF注射至宿主细胞内，是大多数革兰阴性菌发挥其毒性的重要工具[35]。T3SS在革兰阴性菌中高度保守，研究其抑制剂有助于新型辅助抗菌药物的研发。目前已知的T3SS抑制物包括8-羟基喹啉衍生物[36]、白藜芦醇四聚体[37]、2，2′-硫双（4-甲基苯酚）[38]、柚皮素[39]、甘草黄酮醇[40]等，这些小分子化合物能够有效抑制T3SS相关基因的转录或针尖结构的组装，但更为深入的作用机制仍有待进一步探讨。能够同时针对T3SS针状结构蛋白PcrV和胞外脂多糖PsI的双特异性单克隆抗体MEDI3902可同时降低铜绿假单胞菌的黏附能力和致病性，目前已进入Ⅱ期临床试验阶段[41]。

噬菌体是一类对于原核生物具有感染能力的病毒，其在感染末期会通过水解细菌细胞壁的方式破坏细菌结构，以便于成熟噬菌体颗粒的释放。RNA噬菌体或单链DNA噬菌体通过间接干扰宿主菌细胞壁合成的方式导致细菌裂解，而双链DNA噬菌体则直接通过合成一种细胞壁水解酶，即裂解酶或内溶素的方式水解宿主菌的肽聚糖结构。大多数噬菌体裂解酶同时具有N端催化结构域和C端结合结构域的“双结构域”特点，并根据其催化结构域的作用位点分为胞壁酸酶（作用于β-1，4-糖苷键）、肽链内切酶（作用于多肽键）和酰胺酶（作用于酰胺键）等多种类型。

在细菌耐药愈发严重的背景下，噬菌体裂解酶以其独特的优点而越来越受重视。首先，多项研究表明细菌对于噬菌体裂解酶无法产生抗性，这可能与噬菌体和细菌共同进化，其裂解酶经演化后能够高效识别细菌特异性位点有关[42-43]。其次，裂解酶相比抗生素具有更好的特异性。广谱抗生素在杀伤病原菌的同时也破坏了原有的微生态平衡，噬菌体裂解酶的抗菌谱介于抗生素和噬菌体之间，可更好地兼顾抗菌谱与特异性[44]。而且，由于裂解酶直接作用于细菌细胞壁，因此其作用十分迅速，几秒内即发挥裂解作用，纳克级裂解酶即可使细菌浊度出现肉眼可见的下降，Obeso等发现葡萄球菌噬菌体裂解酶LysH5能够迅速杀死巴氏消毒牛奶中的金黄色葡萄球菌，在4 h内将细菌数量降低至检测限以下[45]，在体内实验中也具有较为显著的效果[46]。最为重要的是，噬菌体裂解酶相较于噬菌体本身而言具有极高的安全性，在使用过程中主要关注由于细菌裂解所释放的磷壁酸、肽聚糖等促炎性物质所引发的相关并发症即可[47]。

尽管噬菌体裂解酶仍存在制备和保存条件要求较高、较强的免疫原性、较窄的抗菌谱等缺点，但仍不能改变噬菌体裂解酶作为一种辅助抗菌策略的研究价值和应用前景，运用分子生物学技术在基因水平改造噬菌体，使其能够携带一种或多种高效、广谱的噬菌体裂解酶，从而更好地为临床提供服务是今后的研究方向。

反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs）技术是通过人工合成或构建表达载体制造寡核苷酸片段，从而对目的基因进行抑制、封闭或干扰的一项技术，该技术具有设计简单、易于合成、特异性极高、不产生免疫反应等优点，在新药研发等领域的应用前景十分广阔。目前已应用于原核生物的包括反义RNA（asRNA）、反义DNA（asDNA）和核酶等。其中，反义RNA和DNA分子通过与目的mRNA序列互补结合抑制或封闭目的基因的转录和表达；
而核酶作为一种具有催化功能的小分子RNA，则能够特异性识别并剪切目的RNA分子，从而阻断靶基因的表达。在实验条件下，反义寡核苷酸能够有效干扰细菌关键基因的表达水平，并因此达到一定的辅助抗菌效果。Jeon等通过抑制空肠弯曲菌外排泵基因CmeABC提高耐药菌对环丙沙星和红霉素的敏感性[48]；
Meng等则利用反义寡核苷酸技术降低了金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药能力[49]。

近几年，反义寡核苷酸药物迎来了高速发展期，近3年来由美国FDA批准的各类反义寡核苷酸药物就多达6种。除辅助细菌感染治疗以外，寡核苷酸药物多用于一些罕见、疑难疾病的治疗，有望填补部分疾病治疗方案的空白[50]。然而，反义核酸技术在临床应用中仍面临药物递送效率和体内稳定性两大技术瓶颈。位于体内环境中的寡核苷酸片段具有稳定性差、易降解、难以进入细胞等缺点，因此常需要对其进行化学修饰以提高稳定性，常见的修饰方式包括硫代磷酸脱氧寡核苷酸（phosphorothioate oligodeoxynucleotide，PS-ODN）、磷酰二胺吗啉反义寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO）和肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）等，这一方面有效增强了寡核苷酸药物对核酸酶的抵抗能力，增强其稳定性，但也一定程度上导致了药物亲和力的下降、体内炎症反应等问题[51]。因此在未来几年内，如何将反义寡核苷酸药物有效导入细菌并使其在细菌体内稳定发挥抑制作用，从而削弱细菌的耐药/生存能力，仍是反义技术发展的关键方向。

抗生素的广泛应用曾拯救了无数感染患者的生命，是20世纪最伟大的医学发明之一。然而依据进化论基本原理，其大量使用将不可避免地导致细菌在筛选压力下进化出相关耐药特性。伴随着近年来抗生素滥用情况的加剧、传统抗生素研发进展进入瓶颈期等问题，临床多重耐药细菌比例正逐年上升，可供临床医生使用的相关抗菌药物正逐渐减少，世界正逐步走向“后抗生素时代”。因此，研发新型抗菌药物以满足日益急切的临床需求成为迫在眉睫的重要问题。然而，由于受到目前技术手段的限制，发现一种具有全新作用机制的传统抗生素难以实现，因此从新思路、新角度入手，通过降低细菌毒性、削弱细菌生存性或干扰耐药基因表达等辅助抗菌手段降低多重耐药细菌的治疗难度正越来越受到人们的重视。本文对部分具有潜在临床应用价值的辅助抗菌策略进行了归纳和总结，这些新兴抗菌策略虽然目前尚难进入临床应用，但伴随着未来技术的发展和进步，将有望成为能够显著提高传统抗生素抗菌效果的新型辅助抗菌手段，为研发新一代抗菌药物争取宝贵的时间。

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