Telocytes作为抗胃癌中药潜在作用靶点的探究❋

黄庆宝， 刘 霞， 周红祖， 王 雯， 杨卓凡， 郑智彬， 宣攒威， 罗浩鑫， 余惠旻△

(1.广州中医药大学第四临床医学院深圳市中医院， 深圳 518033；
2.深圳大学医学部， 深圳 518060；
3.深圳市第二人民医院， 深圳 518025)

中国胃癌呈现高发病率、高死亡率的态势[1]，手术、化疗及靶向治疗的预后很差[2]。大部分单靶点抗肿瘤药物的应用都受限于药物的毒副作用和耐药性，这为多靶点作用优势的中药及其复方的研究提供了不可多得的机会。胃癌发生发展以及转移的分子机制尚不明晰，因此寻找更多具有治疗潜力的新靶点成为胃癌机制研究及治疗药物开发的热点和难点。

Telocytes(TCs)中文名译为特洛细胞、终隔细胞、远细胞等，是近年来发现的一种广泛分布在人体各种组织、器官的新型间充质细胞，TCs在肿瘤的发生发展、血管生成及转移过程中发挥着重要作用，有望成为肿瘤治疗的潜在靶点，但研究尚处于起步阶段。2013年Vannucchi MG等第一次提出人胃黏膜、黏膜下层和肌层中都存在数量不等的TCs[3]，但其提供实验图片的正确性有待进一步验证。2018年Riccardo Ricci提示，TCs与血小板源性生长因子受体α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)变异有关的胃间质瘤的发生存在一定联系[4]，但其具体关系不明晰。TCs与胃癌发生发展的关系未明，从TCs的角度阐明胃癌的发病机制具有很大的创新性和可行性。Padhi S等[5]关于“甲磺酸伊马替丁、TCs与胰腺相关疾病”的研究，提示从已有的中药及其复方制剂中发现并找到廉价有效的调控TCs的药物成为可能。

本研究选取人胃的正常及癌变标本，选用CD34、PDGFR-α、c-kit和CD31标记物，采用多重荧光免疫组化技术，结合HE染色、透射电子显微镜、免疫组化等，确定TCs在人胃中的免疫表型、分布及其变化特点，从TCs的角度阐明胃癌的发病机制，将为临床胃癌治疗提供新的靶点，也将进一步丰富和深化对TCs的认知，并有可能在此基础上发现以TCs为作用靶点的抗肿瘤中药复方或化合物。本研究通过深圳大学医学部伦理委员会批准(批号PN-202200055)。

1.1 组织来源与分组

标本组织来源于2020至2022年深圳大学第一附属医院病理科分正常组和胃癌组。正常组包括代谢综合征患者胃部切除的组织标本6例(男2例，女4例，年龄23-40岁，平均28岁)与癌旁组织(距肿瘤边缘大于5 cm)标本19例(男12例，女7例，胃癌病人的年龄36-80岁，平均59岁)，胃癌组组织标本19例(信息同癌旁组织标本)，所有标本均经HE染色鉴定。

1.2 主要试剂及仪器

4%的多聚甲醛(货号P0099-500 mL，上海碧云天生物技术有限公司)；
牛血清蛋白(货号FD0030，杭州弗德生物科技有限公司)；
DAB试剂盒(货号SW1040-1kit，深圳瑞景生物科技有限公司)；
CD34 (ICO115) 抗体(货号MA137329，深圳开克立科技有限公司)；
柠檬酸钠抗原修复液、四色多重荧光免疫组化试剂盒、PDGFR-α、CD31、c-Kit抗体(货号分别为abs9248-100 mL、abs50012-20 T、3174 S、3528 S、37805 S，上海优宁维生物科技有限公司)。

APS300 S组织脱水机、EG1150C石蜡包埋机，RM2235、RM2016石蜡切片机、HI1210摊烤烘片机、EM UC7超薄切片机，德国Leica公司；
BX51正置荧光显微镜、BX61研究级正置自动荧光显微镜，日本OLYMPUS公司；
HT7700钨灯丝透射电镜，日本HITACH公司。

2.1 标本处理

2.1.1 组织石蜡标本制作 选取组织标本，取材面积约为15 mm×15 mm，厚度约为10 mm，常规处理，4%多聚甲醛中固定24 h，修整、梯度脱水、包埋、修蜡。

2.1.2 电镜组织标本制作 将胃部新鲜组织标本(术后)分割成1 mm×1 mm×1 mm大小，常规处理、固定、脱水、包埋，后于45 ℃烘箱内12 h 60 ℃烘箱内48 h固化。

2.2 透射电子显微镜

超薄切片机切片70 mm、3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色、观察、拍片(电压80 kV)。

2.3 HE染色

石蜡切片脱蜡至水，常规方法处理，Harris苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水、封片，显微镜镜检，图像采集分析。

2.4 免疫组化

石蜡标本连续切片常规处理，依次脱蜡、修复、封闭，分别加入一抗CD34(1∶200)、PDGFR-α(1∶500)、CD31(1∶100)和c-kit(1∶100)4 ℃过夜、复温，加一抗放大剂、HRP生物素标记的二抗，DAB避光显色，苏木精复染，1%盐酸酒精分化、返蓝、梯度脱水、透明、封片及镜检，其中空白对照组用PBS代替一抗，其余步骤同上。

2.5 多重荧光免疫组化

按试剂盒说明进行操作，标本经脱蜡分别加一抗CD34、PDGFR-α、CD31和c-kit(浓度同上)，HRP标记的二抗，荧光染料(TSA520或TSA570)等步骤处理后，再次进行抗原修复，加第2种一抗、HRP二抗及另外一种荧光染料 (TSA520或TSA570)后加DAPI工作液，室温孵育、水洗，再加抗荧光淬灭封片剂封片，以相同参数(包括目镜、曝光时间、荧光强度和物镜等)进行免疫荧光图片采集，将CD34/PDGFR-α双阳性表达且有细胞核视为TCs。

2.6 半定量分析

每组随机选取6个相对应的视野部位进行计数。

2.7 统计学方法

3.1 HE染色观察组织病理学

对6例代谢综合征病人正常胃组织标本，19例胃癌病人的正常胃组织及胃癌组织标本进行HE染色，确定组织结构的完整性，鉴定为正常组织及胃癌组织。结果显示，正常胃组织标本中固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层以及浆膜层结构完整，未见炎性细胞浸润(图1A)；
胃癌组织中病理改变不同，有浸润深度限于黏膜及黏膜下层(图1B)、肿瘤组织浸润至浅肌层(图1C)及肿瘤组织浸润至浆膜层(图1D)。

注：A为正常组织，B、C、D为胃癌组织图1 人胃正常组织与癌组织HE染色比较(40×)

3.2 透射电子显微镜观察人胃组织中TCs

选取25例正常组组织标本，使用透射电子显微镜技术确定人胃中TCs的存在。对人胃正常组织中固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层及浆膜层代表性横断面的区域进行观察，发现均有TCs存在，其胞体呈梭形或纺锤形，胞核和胞质比近1∶1，有极细而长且伴有节状膨大的突起(telopodes，Tps)(图2F)。TCs通过Tps紧贴着胃腺，包绕主细胞(图2A)；
TCs胞体呈梭形，与平滑肌细胞伴行(图2B)；
在黏膜下层中存在同型交联，构成3D网络结构(图2C)；
TCs存在于肌层的间质中，Tps短而粗(图2 D)；
在浆膜层中可看到带有一条Tps的TCs，Tps在细长部和膨大部相间呈念珠状(图2E)。

注：A.固有层；
B.黏膜肌层；
C.黏膜下层；
D.肌层；
E.浆膜层；
F.黏膜肌层图2 人胃正常组织透射电子显微镜比较(1000×)

3.3 免疫组化检测人胃组织中TCs的免疫表型

选取25例正常组组织标本，以CD34、PDGFR-α、c-kit和CD31为免疫标记物，采用免疫组化技术确定人胃组织中TCs的免疫表型。结果显示，在胃各层中均有TCs存在，CD34与PDGFR-α标记呈阳性(图3A、B、E、F、I、J、M、N、Q、R)，c-kit和CD31标记呈阴性(图3C、D、G、H、K、L、O、P、S、T)，各层中的免疫表达各具特点，细胞胞体为梭形、扁平状或椭圆形，含有数量不等、形状略有差异的Tps，与TCs、腺体及血管发生同型或异型交联形成网状结构。以固有层为例，不同部位中CD34和PDGFR-α的表达强度各不相同，CD34+细胞在胃小凹和上皮组织中丰度较低，在固有层底部靠近黏膜肌层的内环肌附近丰度最高，PDGFR-α+细胞在胃小凹处丰度较高，呈多点弥散状分布。

注：A～ D.固有层；
E～ H.黏膜肌层；
I～L.黏膜下层；
M～ P.肌层；
Q～ T.浆膜层；
血小板源性生长因子受体α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)图3 人胃正常组织各层免疫组化染色比较(400×)

3.4 多重荧光免疫组化检测人胃组织中TCs的免疫表型

选取25例正常组组织标本，多重荧光免疫组化技术进一步明确CD34和PDGFR-α表达双阳性的TCs。结果显示，正常胃组织各层中均有CD34与PDGFR-α双阳性的TCs存在(图4)。固有层TCs胞体多为梭形，Tps细长弯曲，环绕着胃腺，与胃腺形成异型连接(图4D)；
黏膜肌层TCs胞体多呈椭圆形或梭形，有较多短而粗的Tps(图4H)，在2层平滑肌上的TCs通过Tps包绕着肥大细胞，与血管内皮细胞存在交联(图4F)；
黏膜下层TCs与血管细胞发生异型交联，包绕在血管周围，在疏松结缔组织中TCs形成复杂的同型和异型细胞连接的三维网络结构(图4L)；
肌层TCs伴行于肌束周边、肌层间质及肌间神经丛中，胞体形状为梭形，Tps的轮廓清晰且沿着平滑肌纤维向各个方向延伸，存在相互交联的网络结构(图4P)；
浆膜层TCs间相互交联，分布在结缔组织中，围绕在神经及血管周围(图4I)。

注：A、E、I、M、Q为CD34(红色)；
B、F、J、N、R为PDGFR-α(绿色)；
C、G、K、O、S为细胞核(蓝色)；
D、H、L、P、T为Merge；
血小板源性生长因子受体α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)图4 人胃正常组织多重荧光免疫组化比较(1000×)

3.5 多重荧光免疫组化检测人胃癌组织中TCs的免疫表型

选取正常组组织标本及胃癌组组织标本各19例，采用多重荧光免疫组化技术探讨TCs的差异表达。结果显示，与正常人胃组织中TCs比较，人胃癌组织中，固有层TCs胞体形状多为球状或者椭圆形，Tps短于正常组织(图5A、F)；
黏膜肌层TCs胞体多为梭形或扁平状，Tps细长，Tps上的节点较少(图5B、G)；
黏膜下层，靠近血管附近可以观察到TCs，贴合在血管周边的TCs的数量明显少于正常组织，网状结构缺失(图5C、H)；
肌层TCs均匀分布于肌肉束周边，数量低于正常胃组织(图5D、I)；
浆膜层TCs分布较为松散。人胃癌组织中TCs在数量上呈现减少和缺失趋势(见表1)，正常组织中黏膜下层和肌层TCs的数量明显高于癌组织，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 人胃正常组织与胃癌组织中胃黏膜下层和肌层中Telocytes(TCs)数量比较

注：Control为人胃正常组织；
Cancer为癌组织；
A～E为人正常胃组织各层中CD34 (红色)/ PDGFR-α(绿色)双染；
F～J为人胃癌各层中CD34 (红色)/ PDGFR-α(绿色)双染；
血小板源性生长因子受体α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)图5 人胃正常组织和胃癌组织各层中CD34/PDGFR-α多重荧光免疫组化比较(400×)

近年来，胃癌的治疗手段如手术、化疗、放疗等均有了很大的发展，但疗效并不令人满意，国内外的临床与科研人员一直在探寻胃癌治疗的新方法。靶向治疗联合化疗虽然可以改善包括胃癌在内的实体瘤患者的预后，但靶点阳性患者比例低，不能明确特定靶点人群的特征，无法做到精准治疗，如原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)是目前胃癌中明确的治疗靶点，但在晚期胃癌患者中其阳性率仅为12.1%[6]，在我国患者中这一比例可能更低。因此，从肿瘤生物学、细胞和分子机制的角度探索胃癌治疗的新靶点显得尤其重要。

TCs是近年来发现的一种广泛分布在人体各种器官的新型间充质细胞。研究发现，TCs与子宫肌瘤[7]、乳腺癌[8]、皮肤肿瘤[9]、颗粒细胞瘤[10]、黑素细胞痣[11]等肿瘤的发生有着重要联系，有望成为肿瘤治疗的潜在靶点，但研究仍处于起步阶段。对PubMed中的文献(2010年至2021年)进行统计后发现，TCs相关的论文有489篇，明确表明癌症与TCs有关联的只有子宫肌癌[7]和乳腺癌[8]，涉及人胃的研究论文仅有2篇。2013年Vannucchi MG等虽然第一次提出人类胃黏膜、黏膜下层和肌层中都存在数量不等的TCs[3]，但其提供胃黏膜层的实验图片中，CD34与PDGFR-α阳性表达细胞几乎相同，完全违背了胃部组织细胞学的免疫表型特征，本实验结果(图3)是对该项研究有力的反驳和补充。2018年Riccardo Ricci提出TCs与PDGFR-α变异有关的胃间质瘤的发生存在一定联系[4]，但具体关系不明晰。胃癌中有95%是胃腺癌，4%-5%是胃间质瘤，而PDGFR-α变异有关的胃间质瘤发病率极低，仅占胃间质瘤的6%-7%。因此，TCs与胃生理及病理(胃癌等)的关系研究在全球内仍处于空白阶段。

本研究结果表明，TCs在人胃固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层及浆膜层中均有分布，胃各层组织中CD34、PDGFR-α阳性表达的细胞随位置不同而异(图2、3、4)。与正常人胃组织中TCs比较，固有层癌组织中(图5F)、黏膜下层血管附近(图5H)、肌层癌组织中(图5I)的TCs，其Tps或短于正常组织，或具有较少的节点或网状结构发生改变。肿瘤组织中CD34+/PDGFR-α+TCs的缺失可能是胃癌发生发展的关键机制之一(图5L)，这一结果与肝癌[12]、侵入性乳腺癌[8]等研究结果相吻合。

由于胃部微环境的复杂性以及TCs缺乏特异性的免疫标记，不同组织中免疫表型呈现不一致的状态，给TCs与胃部疾病的研究带来了巨大的障碍。本研究直接选用人胃部正常组织和肿瘤组织，突破了TCs与胃癌研究的瓶颈。本研究首次证实了TCs在胃各层组织(固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层和浆膜层)中有明确的定位、分布与免疫表型。TCs在胃癌发病机理中发挥着关键的作用，具有成为胃腺癌预防和治疗新靶点的潜力，并且可能成为药物抗胃癌作用的潜在靶点。

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