菲咯啉与1‑萘甲酸配体共同构筑的多核Ca、双核Mn配合物的合成、结构及性质

杨婷英 郭 丹 胡宇琼 易思佳 谷淑琪 贺 霞 朱小明 张复兴

(衡阳师范学院化学与材料科学学院，金属有机新材料湖南省高校重点实验室，功能金属有机化合物湖南省重点实验室，湘江上游重金属污染监测与治理湖南省工程研究中心，衡阳 421008)

金属配合物因其种类多样、结构新颖、功能性强，在生物制药、催化、吸附和发光材料等众多领域有着广泛的应用，从而成为近年来合成化学、药物化学和材料化学关注的热点之一[1‑5]。在药物化学研究中，自从发现顺铂对肿瘤细胞表现出强烈的抑制作用[6]，各种金属如铂[7‑8]、钌[9]、锡[10‑11]及其他稀土[12]和过渡金属[13]等抗肿瘤配合物被合成和报道。然而，研究发现金属抗肿瘤配合物或多或少存在耐药性、毒副作用、水溶性差和作用机理尚不明确等问题，因此，设计、合成高效、低毒新型金属抗肿瘤药物及对其作用机制的研究仍然是当前科研工作者面临的挑战和机遇[14‑16]。

菲咯啉(Phen)及其衍生物具有较好的空间平面性、广谱的生物活性，同时其分子结构中2个N原子与金属配位形成的金属配合物显示出良好生物活性、光谱性能等，因而成为近年来的研究热点[17‑19]。利用菲咯啉衍生物与金属形成的配合物的DNA亲和力、光物理和氧化还原特性，可以更深入地研究其与DNA相互作用机制，推动金属抗肿瘤药物的发展[20]。主族元素钙是人体必需的常量元素之一，在运动、生殖、免疫、神经活动等一系列重要生命活动中发挥着十分关键的作用。在传统的金属配合物研究领域中，钙配合物的药理活性研究与过渡金属配合物相比明显偏少。同时，作为配合物的生物活性中心，Ca2+的低毒性和生物安全性是最大优势，具有“安全的轻金属”和“生命必需常量元素”这样的显著特征[21]。过渡金属锰是正常机体必需的微量元素之一，其作为酶的激活剂和必需辅助因子具有许多重要作用，尤其对线粒体氧化还原和细胞凋亡至关重要[22]，与DNA、RNA核糖体结合也会导致蛋白转录和翻译失调[23]。

基于此，我们以刚性平面均较好的Phen和1‑萘甲酸(HNap)为配体分别与一水合醋酸钙和醋酸锰反应，合成了新型Ca、Mn配合物，通过红外光谱、元素分析、热重-差热分析及X射线单晶衍射等技术对配合物进行了表征及结构分析，研究了配合物发光性能，探讨了配合物与小牛胸腺DNA(ct‑DNA)之间的作用形式和作用机理，此外，通过MTT法测试了配合物的体外抗癌活性，为新型金属抗肿瘤药物的设计及应用提供了参考。

1.1 仪器与试剂

主要仪器有IR Prestige‑21型红外光谱仪(日本岛津公司)、PE‑2400型元素分析仪(美国PE公司)、Bruker SMART APEX Ⅱ型单晶衍射仪(德国Bruker公司)、TGA Q50型热重分析仪(美国TGA仪器公司)、RF‑5301PC 型荧光分光光度计(日本岛津)、UV‑Vis 8500型紫外可见分光光度计(日本岛津)、PHS‑3C型酸度计(上海彭顺科学仪器有限公司)。

溴化乙锭(EB)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自阿拉丁试剂公司，ct‑DNA 为 Sigma‑Aldrich公司产品，其他试剂均为市售分析纯试剂，水为超纯水。Tris‑HCl缓冲溶液 pH 值为 7.40，cTris=0.01 mol·L-1。ct‑DNA纯度通过比较260和280 nm处的吸光度来确定(纯DNA的A260/A280=1.8，比值大于1.9时表明有RNA污染；
小于1.6时表明有蛋白质、酚等污染)，浓度根据ε260=6 600 L·mol-1·cm-1确定[12]。EB 溶液通过称取适量EB固体，用pH=7.40的Tris‑HCl(0.01 mol·L-1)缓冲溶液配制。

1.2 配合物的合成

配合物的合成路线如图1所示。具体合成步骤：在50 mL圆底烧瓶中，依次加入Phen(1 mmol)、HNap(2 mmol)、一水合醋酸钙(1 mmol)或醋酸锰(1 mmol)，以及30 mL乙醇，搅拌回流8 h。冷却后，过滤，静置结晶得到配合物[Ca(Phen)(Nap)2]n(1)或[Mn2(Phen)2(Nap)4(H2O)](2)。

图1 配合物的合成线路Fig.1 Synthesis routes of the complexes

配合物1：无色透明晶体，产率82%。元素分析实测值(计算值，% )：C 71.93(72.58)，H 3.98(3.94)，N 5.08(4.98)。

IR 主 要 吸收 峰 (KBr，cm-1)：3 422(m)，3 048(m)，3 007(w)，2 951(w)，1 942(w)，1 636(m)，1 597(s)，1 578(s)，1 557(s)，1 514(m)，1 456(m)，1 423(m)，1 373(s)，1 254(m)，1 211(w)，1 148(m)，1 098(m)，1 028(m)，955(m)，862(s)，845(s)，789(s)，731(m)，652(m)，584(m)，509(w)，473(w)，419(w)。

配合物2：棕黄色透明晶体，产率81%。元素分析实测值(计算值，% )：C 69.72(69.63)，H 4.03(3.95)，N 4.71(4.78)。IR 主要吸收峰(KBr，cm-1)：3 428(w)，3 049(m)，3 013(w)，2 708(w)，1 942(w)，1 601(s)，1 589(s)，1 506(m)，1 456(m)，1 425(m)，1 398(m)，1 371(m)，1 344(m)，1 252(m)，1 217(m)，1 144(m)，1 101(m)，1 011(m)，982(w)，847(s)，797(s)，756(s)，725(s)，652(s)，584(m)，530(m)，511(m)，473(w)，420(m)。

1.3 晶体结构测定

分别选取尺寸为0.28 mm×0.20 mm×0.13 mm(1)和 0.17 mm×0.15 mm×0.14 mm(2)的晶体，在 Bruker SMART APEX Ⅱ型单晶衍射仪上，采用经石墨单色化的MoKα射线(λ=0.071 073 nm)，于296(2)K，以φ‑ω扫描方式收集数据。全部数据经Lp因子和经验吸收校正。晶体结构由直接法解出，除水上的氢原子外，其余氢原子均为理论加氢。水上的氢原子通过差值Fourier合成得到。对氢原子和非氢原子分别采用各向同性和各向异性热参数进行全矩阵最小二乘法修正。全部结构分析计算工作采用SHEXTL‑97程序系统完成。配合物1和2的晶体学数据和结构精修参数列于表1。

表1 配合物晶体学数据Table 1 Crystallographlic date of the complexes

续表1

CCDC：1409882，1；
1409878，2。

1.4 配合物与ct‑DNA作用

用 Tris‑HCl缓冲液配制一系列试样：30 μmol·L-1的 ct‑DNA 和 3 μmol·L-1的 EB，以及不同浓度的配合物。仪器条件：狭缝宽度dex=3 nm，dem=5.0 nm；
激发波长260 nm；
发射波长535～720 nm。测定其荧光发射光谱。

用 Tris‑HCl缓冲液配制一系列试样：32 μmol·L-1的配合物以及不同浓度的ct‑DNA。分别以缓冲液或相应浓度的DNA作空白，在紫外可见光谱仪的双光路系统中，在210～300 nm范围内测定配合物的紫外吸收光谱。

1.5 配合物的体外抗癌活性测试

采用四氮唑盐还原法(MTT法)分别测定配合物和顺铂对人肺癌细胞(NCI‑H460)、人乳腺癌细胞(MCF ‑7)、人 肝 癌 细 胞 (HepG2)和 人 肝 脏 细 胞(HL7702)增殖的抑制活性。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。取处于对数生长期的肿瘤细胞，加入适量的Trypsin消化，使贴壁细胞脱落，用含10% 胎牛血清的RPMI‑1640培养液在含5% (体积分数)CO2、饱和湿度培养箱内于37℃下培养。取96孔板，将测试药液(0.04～10 μmol·L-1)按浓度梯度分别加入各孔中，每个浓度设2个平行孔，于前述培养箱条件下培养72 h，然后每孔加40 μL MTT(用D‑Hanks缓冲液配成4 mg·mL-1)，继续培养4 h，移去上清液，每孔加二甲基亚砜150 μL，振荡5 min，使甲瓒结晶充分溶解，利用Ap22 Speedy全自动酶免分析系统在570 nm波长处检测各孔的光密度。对照药物(卡铂)的活性按照配合物的活性测试方法测定。实验数据应用Graph Pad Prism 5.0统计软件分析，通过存活率数据相对于药物浓度的非线性回归分析(曲线拟合)，用S形剂量响应(变量)方程确定半抑制浓度(IC50)值。

2.1 红外光谱分析

与配体Hnap的红外谱图相比，在配合物1、2的红外谱图中，HNap的C=O伸缩振动的尖锐吸收峰(1 674 cm-1)和O—H伸缩振动的弥散吸收峰(2 623～3 100 cm-1)均消失，而配合物1在1 557、1 373 cm-1和配合物2在1 601、1 371、1 589、1 425 cm-1均出现了新的尖锐吸收峰，分别归属于Nap-上COO-基团的反对称伸缩振动(νas)和对称伸缩振动(νs)特征吸收峰，其峰值差Δν分别为184 cm-1(1)和230、164 cm-1(2)，说明HNap的羧酸基团脱去氢质子，以羧基氧原子与Ca离子发生了双齿桥联配位，与Mn存在双齿桥联配位和单齿桥联配位2种配位形式[24]。中性配体Phen的特征吸收峰中，C=N的伸缩振动峰(1 560 cm-1)和C—H面外弯曲振动峰(854、739 cm-1)分别红移至 1 514、845、731 cm-1(1)和 1 506、847、725 cm-1(2)，表明Phen中的2个氮原子同时参与配位[25]。这些结果与X射线单晶衍射测定的晶体结构结果一致。

2.2 晶体结构分析

配合物1、2的主要键长和键角见表2。配合物的分子结构如图2和3所示。由图2可见，配合物1分子中的 Ca1与O1、O2、O3、O4和 Phen配体中的N1、N2配位形成八面体。其中O1、O3、N1、N2原子共同组成了八面体的赤道平面。其中Ca1与位于平面上方与下方轴向位置O2、O4形成的键Ca1—O2、Ca1—O4键长分别为0.234 5(2)、0.234 8(2)nm。赤道平面上的4个配位原子与金属中心离子Ca1形成的 化学键分 别为 Ca1—N1、Ca1—N2、Ca1—O1、Ca1—O3，其键长分别为 0.252 5(2)、0.251 0(2)、0.226 8(2)、0.224 9(2)nm。由轴向位置 O2—Ca1—O4键角为163.70(9)°，可知分子是以Ca1为中心形成了一个扭曲的八面体构型。有趣的是分子中通过Nap-的羧基氧桥联作用形成了八元环，八元环与八元环之间通过Ca离子的连接形成了一维链状结构，如图3所示。

表2 配合物的主要键长(nm)和键角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complexes

图2 配合物1和2的椭球率10% 的分子结构图Fig.2 Molecular structure of complexes 1 and 2 with 10% probability ellipsoids

图3 配合物1的一维链状结构Fig.3 One‑dimensional chain structure of complex 1

由图2可知，配合物2为一个双核锰配合物结构。Mn1与Mn2分别与来自Nap-中的3个氧原子、水分子中1个氧原子和Phen的2个氮原子配位，形成了六配位八面体构型，其中O7、O9、N1、N2与O2、O9、N3、N4分别组成了以Mn1和Mn2为中心的八面体的赤道位置。Mn1与位于平面上方与下方轴向位置O1、O5形成的键Mn1—O1和Mn1—O5键长分别为0.216 11(13)、0.217 88(13)nm；
Mn2与位于平面上方与下方轴向位置O3、O7形成的键Mn2—O3、Mn2—O7键长分别为0.213 40(13)、0.222 59(13)nm。轴向位置键角N1—Mn1—O9和O3—Mn2—O7分别为 153.86(5)°和 160.14(5)°，均小于 180°。由上述可知，Mn1与Mn2的配位环境基本相同，只是键长和键角稍微有所区别，均是以Mn1和Mn2为中心形成了扭曲的八面体构型。

在配合物1、2结构中，都是以中心钙离子与中心锰离子形成了六配位扭曲的八面体构型，其中均等于1∶1∶2，不同的是配合物1为多核钙一维链状结构，而配合物2形成的是单分子双核锰结构，结构的不同可能是由于中心金属离子的半径、核外电子数不同等。在配合物1中，Phen为双齿配体，Nap-为双齿桥联配体，Nap-与钙离子通过桥式配位形成了一维链状配合物；
而在配合物2中，中心锰离子不仅与配体Nap-和Phen配位，还与1个水分子配位，其中Phen为双齿配体，一个Nap-为双齿桥联配体，另外一个Nap-和水分子为单齿桥联配体，这3种配体的共同作用形成了单分子双核锰的结构。

2.3 配合物的激发波长和发射波长分析

为了检测配合物的发光特性，以甲醇为溶剂配制溶液，在室温下测试了配合物的激发光谱和发射光谱，如图4所示。配合物1和2分别在334和326 nm最大激发波长下，在362和384 nm出现了最大发射峰，斯托克斯位移(最大吸收峰与最大发射峰之间的波长差)分别为28和58 nm，其中配合物2的斯托克斯位移大于大多数荧光染料如荧光素、罗丹明、噁嗪和花青素等(一般小于30 nm)[26]。小的斯托克斯位移导致激发光谱和发射光谱之间的严重串扰，造成成像时信噪比低和严重的荧光自猝灭现象，限制了其在生物成像中的应用，而大的斯托克斯位移可有效减少散射光和激发光对发射光谱的影响，更适合生物成像[27]。另外，配合物1和2的激发光谱和发射光谱均具有很好的镜像关系，这是由于吸收与发射光子时电子跃迁在激发态不同振动能级与基态不同能级时，跃迁几率相似，因此产生如图4的镜像关系[28]。

图4 配合物1和2的荧光激发光谱和光谱Fig.4 Fluorescence excitation and emission spectra of complexes 1 and 2

2.4 配合物的热稳定性分析

为了研究配合物的热稳定性，在氮气保护和加热速度20℃·min-1的条件下，在40～760℃和40～600℃范围分别对配合物1和2进行了热重(TG)分析，测得配合物1和2的TG曲线如图5所示，配合物1的最大失重温区为270～720℃，失重归属于Phen、Nap-的离去，失重率为89.89% ；
2的失重温区为160～190℃和310～510℃，失重分别归属于与Mn配位的水分子和Phen、Nap-的离去，失重率分别为2.02% 和84.52%。假定1和2残余物对应的是CaO和MnO，其质量分数理论计算值分别为9.97% 和12.10%，实测值分别为10.11% 和13.46%，实测值与计算值基本吻合。结果表明，配合物1和2分别在270和160℃以下可以稳定存在。

图5 配合物1和2的TG曲线Fig.5 TG curves of complexes 1 and 2

2.5 体外抗肿瘤活性

配合物1、2的体外抗癌活性测试结果(表3)表明，配合物 1 和 2 对人癌细胞 NCI‑H460、MCF‑7、HepG2增殖均有较高的抑制活性，且其活性均分别明显高于临床使用的卡铂，也高于其对人正常细胞HL7702的抑制活性。与配合物1相比，配合物2对NCI‑H460、MCF‑7、HepG2具有更好的抑制活性，其IC50分别为(2.77±0.03)μmol·L-1、(3.07±1.15)μmol·L-1和(3.73±1.34)μmol·L-1，然而，配合物2对人正常细胞HL7702也有较好的抑制率，其IC50为(3.86±0.12)μmol·L-1。结构决定性质，配合物2的抗肿瘤活性大于配合物1的抗肿瘤活性，可能原因是相比于一维链状多钙核配位聚合物1，双核锰单分子结构的配合物2更容易嵌入到DNA的双螺旋链中，改变和破坏了DNA的结构和功能，从而抑制肿瘤细胞增殖[29]，其更深入的作用机制有待进一步研究。

表3 配合物1、2和卡铂对肿瘤细胞和正常细胞的IC50Table 3 IC50of complexes 1,2 and carboplatin on tumor cells and normal cells μmmol·L-1

2.6 配合物与ct‑DNA相互作用

图6为不同浓度的配合物1、2对EB‑DNA复合体系荧光光谱的影响。从图上可以看出，随着配合物1、2浓度的增加，EB‑DNA复合物体系的荧光逐渐猝灭，说明配合物1、2与DNA作用后，与EB竞争DNA的结合位点使EB从DNA分子中游离出来，由此可进一步说明它们与DNA发生了作用；
并且从猝灭程度上来看，配合物2使复合体系荧光强度的下降趋势更大，初步说明它与DNA的作用更强。根据 Stern‑Volmer校正方程：I0/I=1+(KSV+K)ccomplex+KSVKccomplex2，由曲线拟合推断出配合物与EB‑DNA复合体系的作用属于动态和静态联合猝灭[30]。表明配合物1或2既可以与DNA分子中的磷酸基团静电结合，使DNA分子轴向收缩，把EB从DNA分子的碱基对中挤出；
又可以与DNA分子中的碱基基团配位结合，取代DNA分子碱基对中的EB。这2种作用都导致EB‑DNA体系荧光的猝灭[31]。

图6 配合物1、2对EB‑DNA体系荧光光谱的影响Fig.6 Effects of complexes 1,2 on the fluorescence spectra of EB‑DNA system

为了准确表达配合物与ct‑DNA相互作用的强度，在一定浓度的配合物1、2溶液中加入不同浓度的DNA，测定溶液的紫外吸收光谱，结果如图7所示。当配合物与DNA发生作用时，配合物的紫外可见光谱会表现出红移及减色，且红移及减色的强度与配合物同DNA的作用强度相关。由图7可知，随着DNA浓度的增大，配合物1和2的紫外光谱的减色效应增强，在0～94 μmol·L-1浓度区间减少率分别为5.61% 和12.93%，配合物2的减色效应大于配合物1；
同时，配合物1没有红移现象，而配合物2红移效应比较明显，红移2.0 nm。减色效应和红移数据均表明配合物2与DNA的作用大于配合物1与DNA的作用。为了定量研究配合物1和2与DNA的结合强度，由方程cDNA/(εa-εf)=cDNA/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)]作图[29](其中εa、εf、εb分别为任意DNA浓度下溶液的摩尔消光系数、自由配合物的摩尔消光系数、配合物被DNA完全结合时的摩尔消光系数)，求出配合物1、2与DNA的结合常数(Kb)分别为5.83×103和6.43×103L·mol-1，2的结合常数略大于1，与文献报道的结合常数大小相近，均在同一数量级，这一结果表明配合物与DNA之间均能发生中等强度的相互作用[32]。2种配合物的结合常数与经典沟面结合试剂DAPI的DNA结合常数(8.90×103L·mol-1)相当[33]。表明配合物1、2与DNA的结合模式可能是通过静电作用与DNA骨架发生沟面结合，而配合物2与DNA的沟面结合强度大于配合物1，可能是由于配合物2的空间位阻小于配合物1，因而配合物2更容易紧凑地进入DNA的沟槽[34]。

图7 不同浓度ct‑DNA存在下配合物1、2的紫外吸收光谱Fig.7 UV absorption spectra of complexes 1,2 in the presence of ct‑DNA with different concentrations

利用菲咯啉(Phen)和1‑萘甲酸(HNap)为配体分别与一水合醋酸钙和醋酸锰反应，合成了一维链状多核钙聚合物[Ca(Phen)(Nap)2]n(1)和双核锰单分子配合物[Mn2(Phen)2(Nap)4(H2O)](2)。在配合物1、2结构中，金属离子、Phen、Nap-的物质的量之比均为1∶1∶2，中心钙离子和中心锰离子均形成六配位扭曲的八面体构型。热重分析显示配合物1和2具有较好的热稳定性，分别在270和160℃以下可以稳定存在。配合物的激发光谱、发射光谱存在很好的镜面关系。体外抗癌活性测试显示配合物对癌细胞NCI‑H460、HepG2、MCF‑7均有较好的抑制活性，且高于卡铂；
利用紫外吸收光谱、荧光分光光度法研究了配合物与小牛胸腺DNA的相互作用，结果表明配合物1、2均以静电作用与DNA发生沟面结合。

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