宫颈脱落细胞CircRNA,000284检测在宫颈癌筛查中的作用

巢 薇,覃凤娴,邹 燕,岑福柱,刘小勇

(1.柳州市工人医院,广西 柳州 545000;2.柳州市柳铁中心医院,广西 柳州 545000)

宫颈癌是最常见的一种妇科恶性肿瘤之一，每年宫颈癌在全球女性恶性肿瘤中发病率及致死率均高居第四位。尽管发达国家的子宫颈癌病例发病率在过去十年中有所下降，但发展中国家的发病率继续迅速上升。每年具有大约52.9万新病例和27.5万人死亡，且发病率趋于年轻化[1-2]。目前临床宫颈癌筛查最常用的方法是高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及宫颈细胞学检查，但高危型HPV检测存在灵敏度高但特异性较差的缺陷，而宫颈细胞学检查则存在特异性高但灵敏度差的缺陷[3-4]。寻求一种灵敏度、特异性均理想的新型宫颈癌临床诊断标志物势在必行。CircRNA是近年来研究较热的一类新型非编码RNA[5]，现已发现其对肿瘤的发生、发展、复发和转移有着密切联系。目前文献报道较多的是一些CircRNA在宫颈癌及癌旁组织中的表达情况，而现阶段有关CircRNA在宫颈脱落细胞中表达情况尚未见报道。本文探讨CircRNA000284在宫颈脱落细胞中的表达情况。

1.1一般资料：选取2019年1月～2021年12月柳州市工人医院收治的宫颈癌患者92例(宫颈癌组)，均经临床病理检查确诊，年龄33～75岁，平均(53.9±10.1)岁。纳入标准：①符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准[6]，且经病理确诊为宫颈癌者；
②术前均未接受放射治疗、化疗或生物免疫治疗者；
③能配合本次研究及病历资料完整者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；
②术前已行放疗、化疗或生物免疫治疗者；
另取同期50例健康体检女性作为对照组。获取医疗记录以审查患者数据，包括年龄、肿瘤大小、组织学分级、国际妇产科联合会FIGO分期、淋巴结转移、宫颈浸润深度。所有研究对象签署知情同意书，本次研究经过本院医学伦理委员会同意。宫颈癌患者与对照组年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2CircRNA 000284检测：采用Trizol试剂从宫颈脱落细胞中提取总RNA,用分光光度计测定RNA浓度及纯度，并将1 μg的RNA逆转录成cDNA。Real-time PCR反应：按照试剂盒说明书操作，CDNA 2 μl，GeenRemix TaqⅡ(2×)10 μl,上、下游引物各0.8 μl，ROX 0.4 μl无酶水6 μl，总反应体系共20 μl。反应条件：95℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40个循环，95℃ 30 s，60℃ 15 s，1个循环。Real-time PCR 使用 ABI 7500 扩增仪进行扩增。Trizol试剂、逆转录试剂、荧光扩增试剂及引物均购买于日本Takara公司。每组设3个复孔，分别计算各标本平均循环阈值(CT值)，根据公式2-ΔΔCt，计算CircRNA 000284的相对表达量。2-ΔΔCt数值越大表示对应的CircRNA相对表达水平越高，2-ΔΔCt数值越小表示相对应的CircRNA相对表达水平越低。引物序列CircRNA 000284正义链：5′-TATGTTGGTGGATCCTGTTCGGCA-3′，反义链：5′-TGGTGGGTAGACCAAGACTTGTGA-3′；
GAPDH正义链：5′-GAAGGTGAAGG TCGGAGTC-3′,反义链：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.3高危型HPV分型：采用ROCHE Cobas4800全自动核酸提纯及荧光PCR分析系统进行HPV分型核酸检测，可检出HPV-16、HPV-18以及其他12种高危型 HPV(31/33/51/52/53/58/66/35/39/45/56/59)感染。判断标准:CT<41.0判读为HPV阳性。

1.4统计学方法:采用SPSS20.0统计学软件进行t检验及χ2检验。

2.1宫颈脱落细胞中CircRNA 000284的相对表达量分析:宫颈癌组的CircRNA 000284的相对表达量(2.05)，明显高于对照组的相对表达量(1.0)，差异有统计学意义(t=12.8，P<0.01)。

2.2不同临床病理特征宫颈癌患者宫颈脱落细胞CircRNA 000284相对表达量比较：宫颈癌患者宫颈脱落细胞中CircRNA 000284相对表达量与FIGO分期、病理分化程度、淋巴结转移、间质浸润深度、脉管间隙浸润有关(P<0.05)，而与肿瘤大小无关(P>0.05)。见表1。

表1 宫颈癌患者宫颈脱落细胞CircRNA 000284水平与临床病理特征的关系

2.3CircRNA 000284与高危型HPV分型检测对宫颈癌患者诊断结果比较：CircRNA 000284单一检测敏感性、特异性、诊断符合率均高于高危型HPV分型检测，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CircRNA 000284与高危HPV分型检测检测对宫颈癌患者诊断结果比较[n(%)]

CircRNA是一类内源性非编码RNA，参与了许多重要的生物学过程，包括细胞凋亡、增殖、分化、代谢等过程。大量研究发现CircRNA与多种恶性肿瘤发生与发展相关，目前在宫颈癌中已发现一些异常表达的CircRNA[7-9]。

目前临床研究已表明，高危型人乳头瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的最关键致病因素[10]，欧洲生殖道感染和肿瘤研究组织已经推荐其作为宫颈癌筛查的初筛手段。但由于其存在灵敏度高但特异性较差的缺陷，初筛结果的高阳性率往往会给一些患者带来不必要的心理焦虑。本研究将CircRNA000284与高危型人乳头瘤病毒分型结果进行比较，结果表明CircRNA000284敏感性、特异性、诊断符合率均优于高危型HPV分型检测，说明CircRNA000284对于宫颈癌中诊断应用价值更高。此外，本研究检测所用的宫颈脱落细胞学标本比传统的有创性活组织检查方法更为简便、快捷、经济、安全，可全面了解肿瘤的异质性，更切合精准医疗的理念[11]。

综上所述，检测宫颈脱落细胞中的CircRNA000284，可以用于宫颈癌患者的诊断及病情评估，具有较高的敏感性、特异性及诊断符合率，其有望成为宫颈癌诊断和监测的新型生物标志物。

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