高通量悬浮芯片检测仪器光学系统的设计与实现

【作 者】 娄海芳，章鸿涛，喻梓瑄，王巨锋，刘伟

1 浙江中医药大学附属第一医院（浙江省中医院），杭州市，310006

2 中翰盛泰生物技术股份有限公司，杭州市，311188

随着后基因组时代的到来，人类对生命现象的认识进入全新的发展阶段，对疾病的检测也不再仅仅依赖于单一指标进行诊断，而是将人体作为一个完整的系统，利用多种指标的组合对疾病的发生、发展及预后进行更加精准的检测、判断以及治疗指导[1]。因此，多指标同时检测的方法，特别是面向免疫分析、核酸检测、酶学分析、受体和配体识别分析的高通量、高速度以及多功能的平台技术对临床检测越来越重要[2]。

在这种情况下，悬浮芯片应运而生。悬浮芯片多指标检测技术是集微球编码技术、液流控制技术、激光技术、生物技术及数字信号处理技术为一体的新型生物分子检测技术，也称为液相芯片技术。相比固相生物芯片，悬浮芯片将平板载体替换为编码微球，每个微球都携带一种可识别的编码信息，以便鉴别固定在其表面的探针。一旦微球表面探针种类被识别，探针捕获的靶分子就能够被定性、定量分析[3-5]。

以微球为载体的最大优势源自微球可以在三维空间内快速运动，微球上的生物配体与靶分子之间的杂交、结合近似于液相反应机制，因此反应动力学较固相芯片大为提高[6]。同时，悬浮芯片在荧光编码方式、检测目标分子种类等方面具有良好的灵活性，可根据具体需求更改表面固定有不同探针的编码微球的种类，从而实现个性化检测[7]。

尽管国内目前在悬浮芯片领域已经取得一定发展，但其多指标检测试剂大都基于美国Luminex公司的编码微球发展而来[8-9]。在悬浮芯片检测解码装备方面，目前国内尚未有完整的、专门针对悬浮芯片临床使用的高通量悬浮芯片检测仪器，而Luminex公司提供的设备，其光学系统的性能存在较大缺陷，主要表现为光学系统的抗震性、稳定性较差，荧光收集灵敏度需要进一步提升。根据未来市场应用需求，我们设计了一种应用于高通量悬浮芯片检测仪器的光学模块，配合编码微球可完成对悬浮芯片的自动解码和分析，为悬浮芯片技术在临床的应用提供了完整的解决方案。

为实现对编码微球的解码和对目标待测物浓度的探测，须明确编码微球的编码原理及编码微球工作原理。一般地，编码微球由粒径为微米级的磁性纳米微球内部装载2种荧光素组成，通过人为精准调控荧光素的装载量，形成结构、性状完全一致，仅荧光强度存在差异的编码磁球[10-11]。

图1展示了二维荧光编码的30种编码微球。在1种编码微球表面偶联特定的生物探针，即可捕获1种特定目标待测物。将标记有生物探针的多种编码微球混合并分散于特定溶液，即形成悬浮芯片，可用于捕获多种不同的目标分析物。多指标检测原理如图2所示。

图1 编码磁球阵列Fig.1 Coded magnetic ball array

图2中的过程D展示了悬浮芯片的最终上样检测过程。完成目标待测物捕获后的编码微球悬液将在鞘流池内被鞘液聚焦，以单个编码微球的形式逐个通过激光激发区域，编码微球上的荧光将被激发并为对应的探测器所探测。

图2 多指标检测原理Fig.2 Multi-index detection principle

分析编码微球工作原理可知，完成生物的每一个编码微球都包含3种荧光素，其中两种为编码微球自身携带的用于识别编码微球种类的FL1和FL2荧光素，另一种为前两种通过捕获目标待测物后结合的用于表征目标待测物浓度的FL3荧光素。

编码微球解码示意及E1门内目标待测物荧光强度如图3所示。

图3 编码微球解码示意及E1门内目标待测物荧光强度Fig.3 Coding decoding diagram and fluorescence intensity of tested target in gate E1

由图3可知，不同种类的编码微球解码后呈现聚类效果，每一个群落为一种编码微球，即一个特定的检测指标。一般地，每次测试完成后，一个群落内包含数百到上千个编码微球。对每一个群落内编码微球的FL3荧光素进行单独分析，即可得到不同目标待测物的荧光强度。图3同时展示了群落在E1门内目标待测物荧光强度分布直方图。

2.1 光学模块设计要求

根据编码微球工作原理确定仪器光路设计需求。悬浮芯片检测仪器的光学模块须配备光源和探测器，其中光源要能够激发3种荧光素的荧光信号，其中两种为编码微球本身具备的用于识别编码微球种类的编码荧光素，另一种为前两种生物反应过程中结合的用于表征目标待测物浓度的荧光标记抗体。

在光学模块中采用488 nm蓝光和638 nm红光激光器作为激发光源，所选择的两个激光器均具有良好的单色性和功率稳定性。其中488 nm激光器用于激发FITC和QD605两种编码荧光素，分别对应FL1和FL2，638 nm用于激发荧光二抗标记的荧光素APC，对应FL3。

488 nm波长和638 nm波长激光从激光器出射后，分别经透镜组1和透镜组2对光斑进行首次调整，红光经反射镜反射穿过二向色分镜传输至聚焦透镜，蓝光经二向色分镜反射传输至聚焦透镜。两束激光共同经过聚焦透镜的第二次聚焦，传输至鞘流池。通过对透镜组1和透镜组2的优化设计，在鞘流池的中心的激发位置488 nm和638 nm具有完全一致的光斑尺寸。光学模块的设计原理如图4所示。

图4 光学模块设计原理Fig.4 Design principle of optical module

采用3个光电倍增管（photomultiplier tube,PMT）对3种不同的荧光信号强度进行探测。此外，光学模块还配备了两个散射光探测器，分别为前向散射光和侧向散射光探测通道，由于散射光信号相对于荧光信号属于强信号，采用硅光电二极管即可完成探测。对散射光进行分析可有效识别编码微球是否发生粘连。

当单个编码微球通过激发区域时，各个探测器捕获的光信号经光电转换后均呈现为一个电脉冲信号。单个探测器内脉冲信号的特征值包括信号高度、脉宽、面积等，对每个编码微球的脉冲信号进行分析并提取信号特征值，即可实现编码微球的解码和目标待测物浓度检测。

2.2 激光光斑空间分离设计

当红、蓝两束激光的激发点处于同一位置时，会造成激发的荧光信号形成叠加，如荧光素APC既可被488 nm激发，也可被638 nm激发，此时光电倍增管3（对应FL3）接收到的信号将是两个荧光信号的叠加。这种荧光信号的叠加会导致目标待测物的浓度测值不准确。采用荧光补偿的方式并不能有效消除这种串扰，因此，避免报告通道FL3荧光信号被串扰是极其必要的。

为避免荧光串扰现象，在空间上对红、蓝2个光斑进行分离。在竖直方向上，将红、蓝光斑中心分离数十微米，在鞘流池中心位置的光斑正视和侧视如图5所示。

图5 激光光斑正视及侧视Fig.5 Front and side view of laser spot

当编码微球从下往上通过激光激发区域时将率先被红光激发，APC荧光FL3单独被638 nm激光激发并被探测器探测到，488 nm激光无法激发FL3荧光信号，因此不对信号产生干扰。

当编码微球通过红光激发区域后，进入蓝光激发区域，488 nm信号将对编码信号FL1和FL2同时进行激发。

2.3 高效非球面荧光收集透镜与鞘流池一体化设计

当荧光信号被激发时，向空间的各个方向发散。为对荧光信号进行收集和探测，一般采用一个聚焦透镜对一侧的荧光进行收集。其荧光收集光路示意如图6(a)所示。

由图6(a)可知，鞘流池的中心为激光激发区域，当荧光被激发后，荧光向四周空间发射，部分光线从鞘流池中射出，部分光线从鞘流池光密介质传输到空气光疏介质过程中发生全反射。

当透镜对一侧荧光进行收集时，理论上，最高的荧光收集效率可达25%，但由于光路的损耗和光线全反射的存在，其收集效率必然低于25%。为实现荧光信号的高效收集，对荧光收集光路进行优化设计。根据设计结果计算，采用以上荧光收集光路，在传输距离达150 mm时，光线仍能保持良好的平行度，其发散角小于0.5°，满足实际使用要求。

在光线传输150 mm位置设置探测面，对此处的荧光光强分布进行分析，其结果如图6(b)所示。由探测面的光强分析可知，采用该荧光收集光路，其荧光接收效率高达19.57%。

图6 荧光收集光路示意及探测面荧光光强分布Fig.6 Schematic diagram of collection light path and intensity distribution of detection surface

3.1 光斑性能测试

光斑的性能分析采用间接激发进行测试。已知鞘流池内流体的平均流速为V1，根据层流原理，则编码微球通过激光光斑时的速度为2V1。

在测试过程中，设定V1为3 m/s，则编码微球通过激发区域的速度为6 m/s。已知激光光斑的纵向尺寸为15 μm，而编码微球的直径为3 μm，则理论上，脉冲信号的宽度应为3.5 μs。

采用标记荧光素APC的编码微球进行测试，并采用示波器对FL3荧光通道进行观测。根据理论计算预测，示波器中应观测到2个脉冲信号，其中第一个信号为编码微球通过638 nm激光光斑时被激发形成，第二个信号为编码微球通过488 nm激光光斑时被激发形成。两个信号的宽度应该保持一致，均为3.5 μs。同时，2个信号之间应存在一定的间隔，间隔时间为光斑间隔距离除以编码微球流动速度，约为10 μs。

示波器探测得到的脉冲信号形态如图7所示。

图7 示波器中FL3荧光通道信号形态Fig.7 Signal form of FL3 fluorescent channel in oscilloscope

由图7可知，示波器中信号形态与理论预测保持一致。示波器中横坐标单格为2 μs，两个脉冲信号的宽度均为3.5 μs。同时，2个光斑之间存在一定时间间隔，其间隔时间约为10 μs。

以上结果说明光学系统的光斑尺寸与空间分离距离与理论设计值保持一致，表明光学系统的光斑性能满足设计要求。

3.2 综合性能评估

采用6Peaks标准微球对光学系统的综合性能进行评估。6Peaks标准微球常被用于评估流式细胞仪的各项性能，包括荧光灵敏度、荧光线性等。光学系统综合性能评估结果如图8所示。

图8 光学系统综合性能评估结果Fig.8 Integrated performance evaluation results of optical system

根据测试结果对3个荧光通道的荧光灵敏度进行计算，得到FL1、FL2、FL3的荧光灵敏度分别为40 MESF、28 MESF、13 MESF，荧光线性相关性R2分别为荧光线性0.999 9、0.998 2、1.000 0。以上性能可满足液相芯片解码和目标待测物浓度探测的需求。

在基于流式荧光分析仪器的基础上，笔者提出了创新的光学系统设计，结构上采用了激光光斑整形模块、散射光探测模块、荧光探测模块设计。在获得各编码微球的各荧光波长的荧光强度后，高速信号处理模块将对荧光信号进行数字化处理，转化为数字信号后输送给流式点阵发光分析仪，应用软件进行分析处理。笔者提出的流式点阵仪采用创新性光学系统设计，包括在激光光斑整形光路中，采用二次整形透镜复用设计，保证2个激光光斑在水平方向和竖直方向上的尺寸和能量分布完全一致，确保不同波长激发出的荧光信号形态、宽度完全一致。相比于采用完全独立透镜进行光斑整形的光路，减少了透镜的使用个数，光路结构更为紧凑；
整个光学系统的功能区块采用一体化设计，各模块安装可以一次性完成，安装或更换更为便利；
光学模块整体集成度高、结构精简，通过光路精确计算和机械加工来确保安装位置的准确性，安装完成后，无须调整任何光学器件，生产安装和使用更为便捷。本研究可为流式荧光分析技术的应用和推广提供良好的基础。

猜你喜欢 光斑透镜微球 “透镜”知识巩固中学生数理化·八年级物理人教版(2022年11期)2022-02-14“透镜及其应用”知识拓展中学生数理化·八年级物理人教版(2022年11期)2022-02-14“透镜”知识巩固中学生数理化·八年级物理人教版(2021年11期)2021-12-06『生活中的透镜』知识巩固中学生数理化·八年级物理人教版(2021年11期)2021-12-06悬浮聚合法制备窄尺寸分布聚甲基丙烯酸甲酯高分子微球潍坊学院学报(2020年6期)2020-11-22有趣的光斑阅读（高年级）(2019年9期)2019-11-15有趣的光斑阅读与作文（小学高年级版）(2019年8期)2019-10-16夏末物语小资CHIC！ELEGANCE(2019年28期)2019-09-12葛根素生物黏附微球的制备及评价中成药(2017年6期)2017-06-13大光斑1064nmQ开关Nd：YAG激光治疗黄褐斑的临床研究中国医疗美容(2015年1期)2015-07-12

推荐访问:通量 悬浮 检测仪器