外源性agomir-133在跑台运动改善心脏病理性重塑中的作用

邢 正，陈雪飞，张玉寒，张靖博，张 靓

（北京师范大学 体育与运动学院，北京 100089）

miR-133 由Chen 等（2006）在《自然》杂志（Nature）上首次报道发现，并证实其在成年人心肌和骨骼肌组织中特异性的高表达，被称为肌源性miRNA（myo-miR）。miR-133在肌肉的增殖分化、细胞凋亡、血管生成、脂肪组织褐色化等过程中发挥重要的生物学作用，广泛参与多种疾病的病理生理过程。有研究提示，miR-133 与心肌肥大、心肌梗死和心衰等多种心脏疾病的发生和发展密切相关。在人和动物模型中均观察到病理性心脏重塑以及心肌肥大时，心肌miR-133 的表达水平显著降低。当心脏重塑发展成心力衰竭后，有临床研究表明心肌中miR-133a 的表达水平与心衰的严重程度呈反比（Danowski et al.，2013）。miR-133 可通过抑制其靶蛋白ras 同源物家族成员A（ras homolog family member A，RhoA）、细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42）和活化T 细胞核因子c4（nuclear factor c4 of activated T cells，NFATc4）等表达，发挥强大的抑制心肌肥大的作用（Li et al.，2010）。miR-133 还能通过抑制结缔组织生长因子（connective tissue growth factor， CTGF）（Duisters et al.，2009）、锌指转录因子Snail（zinc finger transcription factor snail）（Muraoka et al.，2014）、I型胶原A1（collagen I A1，Col1A1）（Castoldi et al.，2012）和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）（Shan et al.，2009）的表达进而抑制心肌纤维化，改善心脏重塑。miR-133 抑制心肌细胞凋亡是其发挥心肌保护作用的主要机制。Xu等（2007）研究证实miR-133 能够使大鼠H9c2 心室细胞凋亡基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9（Cysteinyl aspartate specific protease-9，Caspase-9）的总蛋白水平降低89%，降低基础Caspase-9 的活性，阻止了氧化应激诱导的Caspase-9 活性的增加，并通过抑制Caspase-9 间接下调Caspase-3 活性，提高了细胞活力和生存能力，抑制细胞凋亡的发生。

长期规律的有氧运动能够有效降低心血管疾病的发病率，减轻疾病症状，对心血管疾病具有良好的预防和治疗作用。近年来研究发现，运动可以通过调节miRNA 的表达，发挥心肌保护效应。在心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、糖尿病性心肌病、心衰等心脏疾病中，均发现有miRNA 参与了运动的心肌保护作用（Fernandes et al.，2018；
Liu et al.，2015）。

有氧运动及抗阻运动均能调节miR-133 的表达。研究表明，有氧运动可提高循环中miR-133a 的表达以及心肌中miR-133b 的表达（Melo et al.，2014；
Ramasamy et al.，2015），而抗阻运动对miR-133 前体的表达有显著影响（Drummond et al.，2008）。但运动对病理性心肌肥大时内源性miR-133 表达的影响以及miR-133 在运动改善心脏重塑中发挥的作用均鲜见报道。综上，本研究通过腹主动脉缩窄（abdominal aortic coarctation，AAC）建立大鼠病理性心脏重塑模型，进行4 周的跑台运动干预和agomir-133给药后，观察病理性心脏重塑和心肌细胞凋亡的变化，检测心肌和循环中miR-133 表达情况，探讨miR-133 在运动改善心脏重塑中的作用及机制。

1.1 实验动物与材料

所有的动物维持和实验方案均符合北京师范大学伦理与动物委员会的要求（批准号CLS-EAW-2015-002）。5 周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量190～230 g，共24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0001。动物分笼饲养，室内温度（22±5）℃，湿度50%±10%，明暗交替周期为12 h，自由进食和饮水。所有动物饲料及垫料均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，苏木素-伊红染液和天狼星红染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，agomir-133过 表 达试剂（micrON rno-miR-133a-3p agomir，产品编号miR40000839-4-5）及agomir 阴性对照（micrON agomir NC#22，产品编号miR4N0000001-4-5）购自广州市锐博生物科技有限公司，TUNEL 试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司，血浆肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）浓度测定酶联免疫（ELISA）试剂盒购自R&D（美国）。实验中所用其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 实验动物分组与心脏病理性重塑模型制备

实验动物分组：大鼠随机分为假手术组（CON 组，n=6）、腹主动脉缩窄手术（abdominal aortic coarctation，AAC）组（AAC 组，n=6）、AAC＋运动＋agomir-NC 组（A＋E＋NC组，n=6）以及AAC＋运动＋agomir-133 组（A＋E＋agomir-133 组，n=6）。

心脏病理性重塑模型制备：使用腹主动脉缩窄构建大鼠心脏病理性重塑模型。5 周龄SD 大鼠适应性饲养1 周后准备手术，术前禁食12 h，并在手术前自由饮水。通过腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥钠（Sigma，美国）进行麻醉，然后仰卧位固定。大鼠左腹部备皮，3%碘伏消毒；
在左肋弓下缘和腹部中线旁各0.5 cm 处纵向切开1.5～2.0 cm，逐层分离皮下组织、进入腹腔；
在左肾动脉上方分离腹主动脉，用银夹造成腹主动脉部分狭窄（银夹内径0.7 mm）；
在缝合伤口前，将适量的青霉素（400 000 U/mL）滴入腹腔，然后逐层缝合、关腹。假手术组仅打开腹腔，分离腹主动脉，不用银夹缩窄，所有其他步骤与手术组相同。术后正常饮食，密切观察动物反应。

1.3 跑台运动方案及agomir-133注射方案

跑台运动方案：AAC 手术4 周后，A＋E＋NC 组及A＋E＋agomir-133 组大鼠进行跑台训练。第1 周，大鼠每天以5 m/min 的速度运动15 min，进行适应性训练；
第二周开始，大鼠以12 m/min 的速度跑步40 min。所有训练均在下午（15∶00—18∶00）进行，每周进行5 天训练（周一至周五），共进行4 周训练。

agomir-133 注射方案：AAC 手术4 周后，在每周一和周四进行跑台训练前1 h 进行注射，A＋E＋agomir-133 组大鼠于右后肢腓肠肌多点注射agomir-133，A＋E＋NC 组大鼠在相同部位注射agomir-NC，每只每次注射量均为20 μL，浓度12.5 nmol/mL，共注射4 周。

1.4 超声心动检测

大鼠末次运动24 h 后，进行超声心动检测，使用VisualSonics Vevo@2100 小动物超声成像系统（Fujifilm Visual-Sonics，加拿大）。测定前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，胸部备皮，仰卧位将头部及四肢固定在木板上，将探头置于左前胸，与前正中线呈30°左右夹角，显示胸骨旁左室长轴切面，探头顺时针旋转90°可显示左室短轴切面图像。于胸骨旁左室长轴切面二维测量左室室壁厚度等，通过顺时针旋转探头90°显示左心室短轴截面图像，在胸骨旁左心室纵轴上测量左心室壁厚度。在二维图像的引导下，将取样线置于左室健索水平，取M 型曲线，进行心功能测量。超声心动图测量指标包括：左室舒张末期内径（left ventricular inner dimension diastolic，LVID；
d）、左室舒张末期前壁厚度（left ventricular anterior wall diastolic，LVAW；
d）、左室舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall diastolic，LVPW；
d）和左室射血分数（left ventricular ejection fraction， LVEF）。所有测量数据为3 个心动周期的平均值。

1.5 动物取材

动物禁食过夜，自由饮水，腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥钠进行麻醉。经腹主动脉取血，用于各种生化指标的测定，分离心脏组织和腓肠肌进行后续的检测。

1.6 心肌病理组织学观察

心肌、腓肠肌组织置于10%的多聚甲醛溶液，然后于20%蔗糖溶液中浸泡过夜，石蜡包埋，用于石蜡切片，切片厚度为5 μm。用苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色心肌细胞，切片脱蜡复水。苏木素染色15 s，蒸馏水漂洗2 次，再用伊红染色20 s，蒸馏水漂洗2 次。脱水，透明，封片，观察结果。每组切片随机选取5 个不重复视野，并使用Image J 1.8.0 软件分析测定各视野中平均肌细胞横截面积（cross-sectional area）。制备6 μm 的心肌石蜡切片用于胶原纤维的天狼星红染色，切片脱蜡复水，天狼星红染色液滴染1 h，流水稍冲洗，去除切片表面染液，Mayer苏木素染色液染细胞核10 min，流水冲洗10 min。脱水，透明，封片，观察结果。

1.7 Tunel检测

心肌组织石蜡切片脱蜡至水，滴加Proteinase K 工作液，37 ℃孵育20 min，PBS溶液浸润清洗样本3×5 min。滴加破膜液，室温处理20 min，破膜处理完成后PBS 溶液润洗样本35 min；
滴加3%的H2O2（PBS 配制），室温处理20 min，然后使用PBS 溶液润洗样本3×5 min；
滴加Equilibration Buffer，室温孵育10 min，而后加入TdT 孵育缓冲液，37 ℃避光孵育1 h，立即用PBS 清洗4×5 min；
滴加Streptavidin-HRP 反应液，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗3×5 min。DAB 显色10 min，纯水洗涤；
苏木素染液染色15 s，纯水洗涤。而后脱水，透明，封片，观察结果。

1.8 ELISA法

腹主动脉取血10 mL缓慢注入含有10% EDTA-2Na 100μL、抑酞酶50 μL（500 KIU/mL 血浆）（sigma，美国）的试管中，混匀后4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，分离血浆，按试剂盒步骤进行如下测定。取出所需96 孔板，每孔加入50 μL 稀释剂RD1-17；
每孔加入50 μL 标准品、对照品，胶条覆盖，摇床室温孵育2 h。每孔洗涤4 次，在最后一次洗涤后，去除剩余的洗涤液，晾干，每孔加入GDF-80 200 μL，用新的胶条覆盖。摇床室温孵育2 h，每孔洗涤4 次，每孔加200 μL 底物溶液，室温避光孵育30 min，每孔加50 μL 终止液。在反应结束后15 min 内用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔光密度值，并计算血浆中MSTN的浓度。MSTN的ELISA试剂盒灵敏度0.922～5.32 pg/mL，曲线范围0～2 000 pg/mL，批内变异系数＜1.8%，批间变异系数＜3.1%。

1.9 Real-time PCR

使用动物组织总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取腓肠肌和心肌组织的总RNA，并使用天根FASTKING 一步法除基因组cDNA 第一链合成预混试剂（天根生化科技有限公司，北京）进行反转录。Real-time PCR 反应体系共20 μL：Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）体系（全式金生物技术有限公司，北京）15 μL、10 mmol/L 的上下游引物各0.5 μL、cDNA 模板5 μL，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。经94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，热循环40 次，Real-time PCR 于Light Cycler 96 荧光定量PCR 仪（Roche，瑞士）中进行，以GAPDH 作为内参。所用引物序列详见表1。

表1 Real-time PCR测定的基因表达引物序列Table 1 The Primer Sequence of Target Genes

1.10 统计方法

实验数据采用PRISM 9.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），Newman-Keuls 检验组间差异。检验置信区间0.05，P＜0.05 表示差异具有显著性，P＜0.01 表示差异具有非常显著性，P＜0.001 表示差异具有极显著性。实验结果均用平均值±标准差（M±SD）表示。

2.1 跑台运动对AAC大鼠的心脏病理性重塑的影响

与CON 组相比，AAC 大鼠的心脏质量/体质量显著升高（图1A，P＜0.001），二维超声心动图（图1B）及超声心动检测数据表明AAC 大鼠的LVAW；
d、LVPW；
d 以及LVID；
d均显著增加（图1C、D、E，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），LVEF呈降低趋势（图1F）。而运动后大鼠的心脏质量/体质量显著降低（图1A，P＜0.05）。与AAC 组相比，A＋E＋NC 组大鼠LVAW；
d、LVPW；
d 以及LVID；
d 显著降低（图1C、D、E，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），LVEF 出现了升高的趋势，但无显著差异（图1F）。提示AAC 导致大鼠心功能有所降低，心肌出现病理性肥大，而跑台运动使心功能和心肌病理性肥大得到改善。

图1 腹主动脉缩窄及跑台运动对大鼠心脏结构和功能的影响Figure 1. Effects of Abdominal Aortic Coarctation and Treadmill Exercise on Cardiac Structure and Function in Rats

HE 染色结果（图2A）表明，与CON 组相比，AAC 大鼠心肌细胞横截面积显著增大（图2B，P＜0.000 1），天狼星红阳性染色（红色）面积明显增大（图2A），心肌纤维化标志物I型胶原蛋白（collagen I）（图2C，P＜0.01）和Ⅲ型胶原蛋白（collagen Ⅲ）（图2D，P＜0.01）mRNA 的表达均显著升高。对心脏病理性重塑相关基因进行检测后发现，与CON 组相比，AAC 大鼠心肌心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）以及MSTN 的mRNA 表达均显著升高（图2E、F、G，均为P＜0.01）。4 周的跑台运动干预后大鼠的心肌细胞横截面积显著降低（图2B，P＜0.001），天狼星红阳性染色面积减小（图2A），collagen I（图2C，P＜0.001）和collagen Ⅲ（图2D，P＜0.05）的表达显著降低，心肌ANP、BNP 和MSTN 的mRNA 表达显著下降（图2E、F、G，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）。以上结果表明，AAC 大鼠心肌发生了病理性肥大和纤维化，而跑台运动后心肌病理性肥大和纤维化均得到了明显改善。

图2 腹主动脉缩窄和跑台运动对心脏病理性重塑的影响Figure 2. Effects of Abdominal Aortic Coarctation and Treadmill Exercise on Cardiac Pathological Remodeling

2.2 跑台运动对心肌和血浆中miR-133表达的影响

与CON 组相比，AAC 大鼠血浆中miR-133 的表达显著升高，在4 周跑台运动干预后其表达显著回落（图3A，P＜0.000 1，P＜0.05）；
与此相反的是，在心肌组织中检测到AAC 大鼠miR-133 的表达显著低于CON 组，而运动干预后其表达又显著回升（图3B，均为P＜0.01）。

图3 跑台运动对AAC大鼠血浆和心肌组织miR-133表达的影响Figure 3. Effect of Treadmill Exercise on the Expression of miR-133 in Plasma and Myocardial Tissue of AAC Rats

2.3 agomir-133给予在运动改善心肌重塑中的作用

agomir-133 给药后，与A＋E＋NC 组相比，大鼠心脏质量/体质量显著增加（图4A，P＜0.05），二维超声心动图像（图4B）及超声心动结果表明LVAW；
d 和LVPW；
d 显著升高（图4C、D，P＜0.05，P＜0.01），LVID；
d 和LVEF 有下降趋势，但无显著差异，提示agomir-133给药部分抵消了运动对病理性心肌重塑的改善作用。

图4 agomir-133给药合并跑台运动对AAC大鼠心功能的影响Figure 4. Effects of Agomir-133 Administration Combined with Treadmill Exercise on Cardiac Function in AAC Rats

HE 染色结果（图5A）表明，与A＋E＋NC 组相比，A＋E＋agomir-133 组大鼠心肌细胞横截面积显著增大（图5B，P＜0.05），天狼星红阳性（红色）染色面积明显增多（图5A），提示心肌出现肥大和纤维化，同时心肌纤维化指标collagen I和collagen Ⅲ的表达显著升高（图5C、D，均为P＜0.05），心脏病理性重塑相关基因BNP、MSTN 的表达显著升高（图5F、G，均为P＜0.05）。以上结果表明agomir-133 给药部分抵消了运动对病理性心肌重塑的改善作用。

图5 agomir-133合并跑台运动对心脏病理性重塑的影响Figure 5. Effect of Agomir-133 Combined with Treadmill Exercise on Cardiac Pathological Remodeling

agomir-133 给药后，与阴性对照组（A+E+NC 组）相比，血浆中miR-133 的表达出现升高的趋势，但并无显著差异（图6A），而心肌组织中miR-133 的表达在给药后出现了显著的降低（图6B，P＜0.01）。

图6 agomir-133合并跑台运动对循环和心肌miR-133表达的影响Figure 6. Effects of Agomir-133 Combined with Treadmill Exercise on Endogenous Circulation and Myocardial miR-133 Expression

2.4 miR-133 给药对心肌细胞凋亡的影响

对心肌进行TUNEL 检测后发现（图7A），与CON 组相比，AAC 组大鼠阳性染色细胞核（紫色箭头）明显增多，在跑台运动后其数量显著降低，并在agomir-133 给药后又出现增多。同样地，对心肌组织的凋亡相关基因进行检测后发现，与CON 组相比，AAC 组大鼠Bcl2 相关X 基因（BCL2-associated X，Bax）表达显著升高（图7B，P＜0.01）且B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）显著降低（图7C，P＜0.01），Bcl-2/Bax 显著降低（图7D，P＜0.01）；
与AAC 组相比，运动干预使大鼠Bax 表达显著降低（图7B，P＜0.05）；
agomir-133 给药后与阴性对照组（A+E+NC 组）相比，Bax 显著升高（图7B，P＜0.01），Bcl-2 和Bcl-2/Bax 均显著降低（图7C、D，P＜0.001，P＜0.05）。提示AAC 导致大鼠发生了心肌细胞凋亡，在运动干预后得到改善，而agomir-133 给药使运动对心肌细胞凋亡的改善作用消失。

图7 跑台运动、agomir-133合并跑台运动对腹主动脉缩窄导致的心肌细胞凋亡的影响Figure 7. Effects of Treadmill Exercise Alone and Agomir-133 Combined with Treadmill Exercise on Cardiomyocyte Apoptosis Induced by Abdominal Aortic Coarctation

2.5 agomir-133 合并跑台运动对腹主动脉缩窄诱导的肌肉萎缩的影响

与CON组相比，AAC大鼠腓肠肌重量显著降低，并在运动干预后显著回升，但agomir-133给药又导致腓肠肌重量显著降低（图8A，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）。AAC 导致腓肠肌中MSTN的表达显著升高，在运动干预后其表达显著降低，并在agomir-133 给药后显著升高（图8B，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。血浆中MSTN 的浓度也表现出相同的变化趋势（图8C，均为P＜0.01）。腓肠肌H&E 染色（图8E）结果表明，AAC 导致肌细胞横截面积显著减小，运动干预又使肌细胞横截面积显著增大，而agomir-133给药抵消了运动的改善作用（图8D，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）。以上结果提示，AAC 可引起骨骼肌萎缩，运动后得到显著改善，而miR-133在肌肉内的过表达又可导致骨骼肌的萎缩。

图8 跑台运动、agomir-133合并跑台运动对腹主动脉缩窄诱导的肌肉萎缩的影响Figure 8. Effects of Treadmill Exercise Alone and Agomir-133 Combined Treadmill Exercise on Muscle Atrophy Induced by Abdominal Aortic Coarctation

本研究使用AAC 构建了大鼠心脏病理性重塑模型，AAC 导致大鼠心脏质量/体质量增加，左室壁增厚，心肌发生纤维化，ANP、BNP 以及MSTN 的表达显著升高，表明心脏病理性重塑模型成立。AAC 大鼠循环中miR-133的表达显著升高，而心肌中miR-133 的表达则显著降低。4 周的跑台运动干预明显改善了大鼠的心脏病理性重塑，并使循环中miR-133 的表达显著降低而心肌中miR-133 的表达升高。为了进一步验证miR-133 在运动改善心肌重塑中的作用，本研究对AAC 运动大鼠外源性的补充了agomir-133，发现运动对大鼠病理性心肌重塑的改善作用消失，同时心肌细胞的凋亡显著增加。以上结果表明，运动通过促进心肌miR-133 表达，减少循环miR-133 水平，产生心脏保护效应，外源性miR-133给予抵消了运动的保护作用。

由于miRNA 在细胞的各个生命活动环节均发挥重要调控作用，所以近年来miRNA 备受关注。目前发现有数千种miRNA，它们在机体中的表达有着明显的组织特异性（Lagos-Quintana et al.，2002）。miR-133 被证实在成年人心肌和骨骼肌组织中特异性高表达，因此被称为肌源性miRNA。近年来研究发现miR-133 与某些心脏疾病的关系较为密切。有研究表明在多种因素诱导的病理性心脏重塑时，心肌中miR-133 的表达水平显著降低。在肥大性心肌病患者中，心房和心室肌的miR-133a 表达下调。在腹主动脉缩窄（Hua et al.，2012）和主动脉弓缩窄诱导的心肌肥大小鼠模型（Carè et al.，2007）中，心肌miR-133 的表达显著下调，在血管紧张素II（Castoldi et al.，2012）和高血压诱导（Duisters et al.，2009）的心肌肥大的模型中，心肌、心脏成纤维细胞miR-133 的表达也显著下降。有临床研究表明，心肌中miR-133a 的表达水平与心衰的严重程度呈反比（Danowski et al.，2013）。心肌梗死患者心肌中的miR-133a 表达显著降低（Emanuela et al.，2010），在心肌梗死的动物模型上同样观察到心肌miR-133 的表达出现显著降低（Sun et al.，2020；
Zhang et al.，2019）。但血液中miR-133 的表达变化与心肌中不一致，不论是心衰患者（Ben-Zvi et al.，2020），还是心梗患者（Peng et al.，2014），循环中miR-133 的表达均显著升高。与前期研究结果一致，在本研究中，AAC 诱导的病理性心脏重塑大鼠心肌中miR-133 的表达显著降低，而血液中miR-133 的水平则显著升高。

运动对miRNA 的表达具有显著的调节作用，但与运动方式、运动强度和运动结束后的测定时间有关。成年男性马拉松比赛后血清miR-133a 水平显著升高（Mooren et al.，2014），健康的成年男性在经过急性耐力运动后3 h，骨骼肌活检发现miR-133a/b 的表达分别上调35%和40%（Russell et al.，2013）。Nielsen 等（2010）研究也证实骨骼肌miR-133a的表达在60 min 有氧运动后明显升高，而经过12 周耐力训练后，骨骼肌miR-133a 的表达水平在运动前后未发生明显变化。抗阻运动则上调了pre-miR-133 的表达，但成熟miR-133 表达降低或不变。也有研究报道了运动对心肌中miR-133 表达的影响。Palabiyik 等（2019）研究表明8 周的游泳运动使大鼠心室肌中miR-133的表达显著升高；
Fathi等（2020）也发现14 周的耐力训练使大鼠出现生理性心肌肥大，且左心室miR-133 表达显著增加。但在病理性心脏重塑时，运动对miR-133 的调节尚未见报道。本实验结果表明，4 周跑台运动使AAC 大鼠心肌miR-133 表达水平显著升高，同时循环中miR-133 的水平显著降低，提示跑台运动调节miR-133的表达可能是运动防治心血管疾病的机制之一。根据已有研究提示，运动调节肌源性miR-133 的表达可能与转录因子MyoD、myogenin、PI3K/AKT/mTOR 信号通路等作用机制相关（Pegoraro et al.，2020；
Soplinska et al.，2020）。

miR-133 抑制心肌细胞凋亡是其发挥心脏保护作用的重要机制。在β1 肾上腺素受体持续激活诱导的心肌细胞凋亡时，miR-133 能显著抑制凋亡的发生，miR-133 可以下调60% β1肾上腺素能受体mRNA 表达，抑制受体通路的激活，发挥抗心肌凋亡的作用（Nader et al.，2021）。miR-133 还通过抑制caspase-9 的表达，抑制尼古丁诱导的心肌凋亡（Jan et al.，2012）。本研究发现AAC 大鼠的心肌细胞凋亡数量显著增加，4 周跑台运动干预后，细胞凋亡得到显著改善，上述改变与心肌miR-133 的表达变化同步，提示心肌组织中的miR-133可能通过抗细胞凋亡发挥心肌保护作用。

为了验证miR-133 在运动改善心脏病理性重塑中的作用，本研究对运动干预大鼠同时外源性给予了agomir-133，结果与多数miR-133 发挥心脏保护作用的研究结果不同，本研究发现腓肠肌注射agomir-133 并没有发挥对心脏病理性重塑的改善作用。与以往研究相比，本研究的给药部位以及靶向性有所不同。Chen 等（2017）将过表达miR-133 的间充质干细胞直接注射到心肌梗死大鼠的心肌组织中，Sun 等（2020）对大鼠尾静脉注射携带miR-133 的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽（RGD）修饰的聚乙二醇（PEG）-聚乳酸（PLA）纳米粒（PEG-PLA/miR-133），对心肌组织具有较高的靶向性。本研究采用了肌肉注射，并选取了目前应用较为广泛的agomir 实现过表达。agomir 是人工合成并经过特殊化学修饰的miRNA 片段，通过模拟内源性miRNA 来调节靶基因mRNA 的表达而发挥作用（Mai et al.，2019）。与其他过表达试剂相比，agomir 在动物体内具有更高的稳定性和活性，作用时间长，不依赖载体，对各种器官组织均可发挥作用。但有研究提示，局部注射agomir可能无法到达外周组织发挥作用。Zhang 等（2021）将0.25 nmol/g 体质量的agomir-30b 注射到小鼠的褐色脂肪组织中，发现心脏、肝脏等外周组织中miR-30b 的表达无显著升高，表明局部agomir-30b 给药对其他组织不产生影响。本研究以局部给药的方式对腓肠肌进行了多点注射，并检测了血浆和心肌miR-133 表达的变化，发现注射agomir-133 后心肌miR-133 表达显著降低，在血浆中也未发生显著变化。由于腓肠肌以快肌纤维为主，血管数量较少，推测agomir-133注射后难以进入循环及外周组织发挥作用。

本研究发现，肌肉agomir-133 给予不但没有发挥心脏的保护作用，还抵消了运动对心脏病理性重塑的改善作用。进一步研究发现，肌肉agomir-133 给予后，骨骼肌出现严重萎缩，推测miR-133 过表达导致的肌肉萎缩通过外周机制加重心脏病理性重塑。以往研究也证实miR-133 与肌肉萎缩有关（Cacchiarelli et al.，2011；
Ringholm et al.，2011；
Williams et al.，2009），并将miR-133 作为临床上肌病的诊断指标。目前研究提示，骨骼肌质量与心血管疾病的发生及预后密切相关。流行病学研究发现骨骼肌质量的减少增加了冠心病患者的死亡风险（Nichols et al.，2019），骨骼肌质量与心血管疾病风险呈正对数线性相关（Knowles et al.，2021），肌少症患者骨骼肌质量的减少会对心衰病人的预后产生不良影响（Emami et al.，2018；
Von，2018）。研究表明骨骼肌和心肌之间存在交互作用。肌肉萎缩时其胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）、神经调节蛋白1（Neuregulin，NRG1）、机械生长因子（mechano growth factor，MGF）以及卵泡抑素样蛋白1（Follistatin-like protein 1，FSTL1）的表达显著降低，与心功能的减弱及心梗的发展有关（Cai et al.，2016；
Xi et al.，2021）。MSTN 是肌肉生长的负性调控因子，主要由骨骼肌分泌，有研究报道肌肉萎缩 合 并 心 衰 小 鼠 血 浆MSTN 明 显 增 加（Heineke et al.，2010），且MSTN 可引起心肌纤维化和心衰等症状（Yoshida et al.，2013）。本研究中腓肠肌注射agomir-133 后发生萎缩，腓肠肌以及血浆中MSTN 的表达均显著升高。提示agomir-133 给药引起的肌肉萎缩可能诱导肌源性MSTN及其他外周机制作用于心脏，加重了心脏病理性重塑。但具体机制如何还需进一步探究。

AAC 诱导大鼠发生心脏病理性重塑，心肌中miR-133表达降低，循环中miR-133 水平增加。4 周的跑台运动显著改善了AAC 诱导的心肌肥大和纤维化，抑制了心肌细胞凋亡，同时增加了心肌miR-133 表达，降低了循环中miR-133 的水平。外源性的agomir-133 给药使心肌内源性miR-133 表达降低，抵消了运动对心脏病理性重塑的改善和抗凋亡作用，并引起骨骼肌萎缩。miR-133 在运动改善心脏病理性重塑中发挥重要作用，其在骨骼肌内的过表达可引起肌肉萎缩，并可通过外周机制抵消运动对心脏病理性重塑的改善作用。

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