暗色丝孢菌中2个中国新记录种和1个中国大陆新记录种

肖仲久，刘 婷，钱正敏，李小霞，杨 泽，陆铮铮，宋培勇，陈模芳

1.遵义师范学院资源与环境学院，贵州遵义 563002；
2.遵义师范学院生物与农业科技学院（食品科技学院），贵州遵义563002；
3.贵州省赤水河流域植物资源保护与应用特色重点实验室，贵州遵义 563002

Beltraniella由 SUBRAMANIAN[1]在马德拉斯（印度港市）从枯死的厚皮树Odina wodierRoxb.[≡Lannea coromandelica(Houtt.) Merr.]的叶片上获得菌株，以B.odinaeSubram.为模式种建立的。目前该属在 Index Fungorum中共有 29个种被记录，其中B.porosaPiroz.& S.D.Patil [≡Porobeltraniella porosa(Piroz.& S.D.Patil) Gusmão]和B.patiliiK.G.Karand.& Patw.[≡Porobeltraniella patilii(K.G.Karand.& Patw.)Gusmão]2个种的分生孢子最宽处有圆形孔带，因此 FERNANDO等[2]将这 2个种移入PorobeltraniellaGusmão中，现今Belraniella有效种共 27个。该属典型特征如下：刚毛状分生孢子梗的隔膜处易产生侧向分枝，分枝可进一步分支形成产孢细胞或分离细胞，其上以顶侧生方式产生鼻甲或倒圆锥形，0个隔膜，光滑，半透明至浅褐色，具明显透明横带的分生孢子。该属产孢方式及分生孢子的形状与BeltraniaPenz.、BeltraniopsisBat.& J.L.和Porobeltraniella相似，Beltrania的分生孢子梗产生于刚毛的基部细胞或单独的放射状浅色细胞，分生孢子双锥形，顶端常具透明丝状附属物；
Beltraniopsis不分枝或分枝的刚毛状分生孢梗产生不对称双锥形且顶端具短喙的分生孢子；
Porobeltraniella不育的侧刚毛上产生产孢装置（产孢细胞），其上产生具透明、多个赤道孔的分生孢子[2-4]。

Subulispora由TUBAKI等[5]在日本的长尾栲（Castanopsis cuspidataSchottky var.sieboldii）获得菌株，以S.procurvataTubaki作为模式种建立，随后在瓜达尔卡纳岛、坦桑尼亚、肯尼亚、印度、巴西和中国台湾等有报道。目前该属在 Index Fungorum中有16个种，其中S.hareaeB.Sutton因分生孢子链生，KIRK[6]将S.hareae[≡Polyscytalum hareae(B.Sutton) P.M.Kirk]移入PolyscytalumRiess中；
而S.gracile(Matsush.) de Hoog和S.variabilede Hoog分生孢子梗的薄壁、透明，CASTAÑEDA 等[7]将这 2个种移入CylindrosympodiumW.B.Kendr.& R.F.Castañeda中，故该属目前共有13个有效种。该属典型特征如下：粗大，褐色，曲膝延伸，具明显锯齿形的分生孢子梗顶生单生，苍白色，锥形或圆柱形，直或弯曲，基部平截，具0或多个隔膜的分生孢子。Subulispora在产孢方式及分生孢子形状上与Cylindrosympodium、Polyscytalum、MirandinaG.Arnaud ex Matsush.和ParasympodiellaPonnappa四个属相似，其中Cylindrosympodium分生孢子梗半透明至透明；
Polyscytalum分生孢子梗合轴式延伸，但具不明显锯齿，分生孢子链生；
Mirandina分生孢子梗顶部区域膨大、聚集圆柱形小齿，分生孢子纺锤形；
Parasympodiella分生孢子梗以体生式方式产生链生分生孢子。

Beltraniella和Subulispora隶属于暗色丝孢菌（dematiaceous hyphomycetes），该类群真菌在自然生态系统中对木质素、纤维素降解，物质和能量循环转化及在维持生态系统平衡中具有重要的生态学作用[8-10]。因此，目前深入系统地开展暗色丝孢真菌的鉴定，对丰富我国该类真菌资源及后续对该类真菌开展降解有机物、维持生态系统平衡等研究均具有重要的支撑意义。

1.1 材料

2018—2019年7 —8月、10—12月，采集贵州省习水国家级自然保护区和贵州省宽阔水国家级自然保护区的不同生境下的凋落枯枝落叶（腐烂适中），标注采集地、时间、基质（可辨认）、海拔和经纬度等。

1.2 方法

将采集的凋落枯枝裁剪成6~7 cm小段，置入铺有湿润吸水纸的塑料培养皿内（落叶可整片保湿在磁盘内），不定期保湿，25℃培养，以备镜检。将上述凋落枯枝落叶置于SMZ 745T体视显微镜下，用细挑针挑取菌株制成临时玻片，在Eclipse E200生物显微镜下选取合格的临时玻片制成永久玻片；
随后在 ECLIPSE Ni微分干涉显微镜和SMZ745T体视显微镜下分别根据菌株的形态大小和基质上菌落大小在相应的倍数下拍照，用Image-Pro Plus 5.0软件和Adobe Photoshop CS6进行测量及组图，通过查阅相关资料，结合菌株形态特征及相关测量数据进行属、种的形态学鉴定。

将分离成功的菌株进行基因组 DNA提取[真菌基因组 DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司]，选择引物 ITS4/ITS5和28S1/28S3[11]；
使用 50 μL的 PCR反应体系，包括正反向引物各 2 μL，DNA 模板 2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。扩增 ITS 的反应条件为：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，57℃退火50 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸10 min。将获得的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。

测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。序列剪接使用Chromas软件，序列对比使用 NCBI中的Blast工具。系统发育树的构建采用Mega X的ML（maxium likelihood）法，自展重复次数设置为 1000。参与分析的序列包括自测序列（其DNA序列均提交至GenBank）和GenBank中下载的相似属和同属相似种的序列（表1和表2）。

表1 用于构建系统进化树的菌株及GenBank登录号Tab.1 Strains used in phylogenetic analyses and their corresponding GenBank accession numbers

表2 用于构建系统进化树的菌株及GenBank登录号Tab.2 Strains used in phylogenetic analyses and their corresponding GenBank accession numbers

2.1 可育小贝氏孢（Beltraniella fertilis Heredia, R.M.Arias, M.Reyes & R.F.Castañeda）

在腐烂的枯叶上腐生。有性态：未发现。无性态：菌落腐生在叶片的两面，舒展，薄壁，灰褐色；
在PCA培养基上，菌落最初白色，随后变为灰色至灰褐色。菌丝部分埋生在基质内，由具隔、分枝、壁光滑、半透明至浅褐色，宽1.5~2 μm的菌丝体组成。刚毛简单，产生于放射状、浅裂的基部细胞，宽6.5~15.5 μm，直立，直或稍弯曲，单生或少部分聚集，黑褐色，薄壁，0~3个隔膜，长57~125 μm，基部和顶部光滑，中下部具有稀疏的疣状突起，中下部宽4~5 μm，顶部逐渐变细，浅褐色。分生孢子梗粗大，单生，具长的刚毛状和短的非刚毛状2种类型：长的刚毛状的分生孢子梗产生于放射状、浅裂的基部细胞，单生或小数聚生，直，7~12个隔膜，大小156~392 μm×4.5~8 μm，基部和顶部光滑，中下部具有稀疏的疣状突起，厚壁，顶部区域分枝；
短的非刚毛状分生孢子梗分枝，0~2个隔膜，壁光滑，半透明至透明，薄壁，6~12 μm×3.5~5.5 μm。产孢细胞多芽生，合生，端生，棍棒状至圆柱形，顶端或亚顶端具小齿，浅褐色，6~12 μm×3~5 μm。分离细胞卵圆形或倒卵形，薄壁，光滑，透明，6.5~11 μm×3.5~5.5 μm，两端各具一个小齿。分生孢子直接产生与产孢细胞上或产生于分离细胞上，远极端平截，近极端具喙状凸起，光滑，赤道带以上具半透明至浅橄榄色的横带，17~23 μm×5~7 μm（图1）。

图1 可育小贝氏孢（HMZNC0810）Fig.1 Beltraniella fertilis (HMZNC0810)

研究标本：贵州省习水国家级自然保护区，28°31′2.04″N，106°23′56.05″E，海拔 1033.9 m；
基质为广玉兰（Magnolia GrandifloraL.）凋落枯叶；
2019年7月25日；
标本号为HMZNC0810。

Beltraniella所记录的27个有效种中与菌株相似的种为B.fertilisHeredia, R.M.Arias, M.Reyes& R.F.Castañeda、B.ramosiphoraC.G.Lin & K.D.Hyde和B.pseudoportoricensisCrous，其中B.ramosiphora的长分生孢子梗不分枝，且短的分生孢子梗较长（20~55 μm）[12]，B.pseudoportoricensis的分生孢子较长些（25~27 μm）[13]；
而B.fertilis与本菌株相比分生孢子的长度（19~22 μm vs 17~23 μm）基本一致[14]，同时在刚毛、2种类型的分生孢子梗、分离细胞上也基部一致。从图2可知，各菌株明显分为2支，Beltraniella所供试菌株均在一个亚枝上，菌株（HMZNC 0810）与B.fertilis的亲缘关系最近，与Beltraniella的其他种能明显分开；
另外，菌株在形态与相似属种也存在较大差异。结合形态特征和系统学分析，将菌株（HMZNC 0810）定为B.fertilis。B.fertilis在墨西哥韦拉克鲁斯、泰国、巴西有报道，但在中国属于首次报道，故将其定为中国新记录种。

图2 基于LSU和ITS序列对可育小贝氏孢构建的进化树Fig.2 Phylogentic tree of Beltraniella fertilis generated based on combined LSU and ITS sequences

2.2 柱孢锥孢（Subulispora cylindrospora P.M.Kirk）

在枯枝上腐生。有性态：未发现。无性态：菌落舒展，薄壁，绒毛状，灰褐色。菌丝部分埋生在基质内，由光滑、分枝、具隔、浅褐色菌丝体组成。分生孢子梗粗大，单生，直立，简单，直或稍弯曲，上部具明显的膝曲状，呈“之”字形，褐色，顶部浅色，光滑，2~5个隔膜，大小33~78 μm×2.5~4.3 μm，基部宽 3~5.7 μm。产孢细胞合生，端生，多芽生，合轴式延伸，具明显的产孢痕。分生孢子单生，干质，顶侧生，光滑，透明，圆柱形，稍锥型，顶部钝圆，基部平截，并具一个增厚、稍显色素的疤痕，(2-) 5~6 (-8)个真隔膜，大小 34.7~77 μm×2~3 μm（图3）。

图3 柱孢锥孢（HMZNC0813）Fig.3 Subulispora cylindrospora (HMZNC0813)

研究标本：贵州省宽阔水国家级自然保护区，28°02′3.2″N，107°10′51.24″E；
海拔 1103 m；
基质为未鉴定枯枝；
2019年 7月 26日；
标本号为HMZNC0813。

Subulispora所记录的13个有效种中，分生孢子为圆柱形且顶端无附属物的种为S.minimaP.M.Kirk、S.africanaP.M.Kirk和S.cylindrosporaP.M.Kirk。S.minima的分生孢子梗较短（4~15 μm）且透明；
S.africana的分生孢子隔膜数较少（3~4个），且较短（31~33 μm）；
S.cylindrospora在分生孢子梗长度（24~68 μm）、分生孢子隔膜数（5个）及大小（37~56 μm）（Kirk 1985）与菌株基本一致[15-17]。HMZNC 0813菌株在PDA、PCA等不同培养基质上进行单孢分离，通过平板划线分离法进行分离纯化，可能由于自然基质上存在过多的杂菌、目的菌株数量较少、不集中、目的菌株上表面附带其他菌类等原因，最终未获得纯菌种，但通过形态学特点及测量数据，可将其明确定为S.cylindrospora。S.cylindrospora在国外肯尼亚有报道，但在中国未见报道，因此将该菌株定为中国新记录种。

2.3 前弯锥孢（Subulispora procurvata Tubaki）

在枯枝上腐生。有性态：未发现。无性态：菌落生长在叶子的两面，舒展，薄壁，绒毛状，灰褐色；
在PCA培养基上最初白色，后期灰色至灰褐色，而PCA的反面深褐色。菌丝部分埋生在基质内，由光滑、分枝、具隔、浅褐色，宽2~2.5 μm的菌丝体组成。分生孢子梗粗大，单生或少数聚生，直立或稍弯曲，上部明显的膝曲弯曲，呈“之”字形，褐色，顶端浅色，光滑，具长和短2种类型：长的分生孢子梗 4~6个隔膜，大小 72~145(-179)μm×3~5 μm，产生于放射状浅裂的基部细胞，宽9.3~15 μm；
短的分生孢子梗0~2 (-3)的隔膜，42.5~52.5 μm×3~5 μm，产生于放射状浅裂的基部细胞，褐色，宽 5~7 μm。产孢细胞合生，端生，多芽生，合轴式延伸，具明显的产孢痕。分生孢子单生，干质，顶侧生，光滑，透明，锥形，0~3个隔膜，长25~33.5 μm（不包括附属喙），平截的基部宽 2.2~3.5 μm，基部弯曲的顶端延伸形成一个细长的附属喙，6~11.6 μm×0.8~1.1 μm（图4）。

图4 前弯锥孢（HMZNC0814）Fig.4 Subulispora procurvata (HMZNC0814)

研究标本：贵州省宽阔水国家级自然保护区，28°15′2.25″N，107°11′18.70″E，海拔 1314.5 m；
基质为未鉴定的凋落枯叶；
2019年7月26日；
标本号为HMZNC0814。

Subulispora所记录的 13个种中，在形态上分生孢子锥形、顶端不分枝且具一定程度弯曲的附属丝的种为S.procurvataTubaki和S.longirostrataNawawi & Kuthub。S.longirostrata的分生孢子具较长的附属丝（15~25 μm），在附属丝的拐点上具弧形缺口[18]；
S.procurvata的分生孢子梗长度（20~190 μm）、分生孢子的隔膜数（3个）、分生孢子大小（28~40 μm）（不包含附着丝）等[18]特征基本与HMZNC 0814菌株一致，但模式种S.procurvata未提到有2种类型的分生孢子梗，本菌株形态上具明显的2种类型的分生孢子。从图5可知，各菌株明显分为2支，Subulispora所供试的菌株均聚在一个亚分枝上，其中HMZNC 0814菌株和S.procurvata以94%进化支持率聚为一分支，亲缘关系最近，与Subulispora属的其他种能明显分开。结合形态特征和系统学分析，将HMZNC 0814菌株定为S.procurvata。S.procurvata在日本、巴西、澳大利亚、中国香港等有报道过，故将其定为大陆新记录种。

图5 基于LSU和ITS序列对前弯锥孢构建的进化树Fig.5 Phylogentic tree of Subulispora procurvata generated based on combined LSUand ITS sequences

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