高龄卵巢低储备人群不同促排卵方案的临床评价*

简生燕 熊正方 马荣花 曾湘晖 王睿 李斌业

(青海省人民医院生殖医学中心，青海 西宁 810001)

自2015年10月全面实施二胎政策以来，高龄夫妇的生育需求也随之增加，但年龄的增加导致卵巢功能及卵母细胞质量的下降和各种盆腔疾病的增加致使35岁以上的高龄女性妊娠率显著下降，流产率增加[1-3]。体外受精-胚胎移植(Vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)或单精子卵泡浆内注射-胚胎移植(Intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI)的治疗方法为她们的生育需求提供了技术支持，良好的妊娠结局取决于高质量卵子及优质胚胎。目前高龄卵巢低反应患者在IVF-ET促排卵过程中以促性腺激素释放激素拮抗剂(Gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRH-ant)方案(简称为拮抗剂方案)、高孕激素状态下促排卵 (Progestin primed ovarian stimulation,PPOS)方案(简称为PPOS方案)和微刺激方案为主。而促性腺激素释放激素激动剂(Gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)降调节长方案(简称为长方案)较少应用于该类人群，本文探讨高龄卵巢低储备患者应用长方案、拮抗剂方案和PPOS方案的实验室指标及临床结局，旨在寻找适宜于高龄女性最优的促排卵方案，助力该类人群的辅助生育获得最佳结局。

1.1 一般资料 本研究纳入2016年3月～2019年3月在青海省人民医院生殖中心接受IVF助孕治疗的高龄卵巢低储备者377个周期的临床资料。PPOS方案(PPOS组)198个周期、长方案(长方案组)103个周期和拮抗剂方案(拮抗剂组)76个周期。患者平均年龄(39.43±3.53)岁，平均BMI(22.37±3.08) kg/cm2，平均不孕年限(4.36±3.55)年。其中原发不孕123个周期(32.6%)，继发不孕254个周期(67.4%)。参照其他研究[4-7]，制定纳入标准：①年龄≥35岁。②阴道超声提示早期双侧卵巢窦卵泡数(Antral follicle count，AFC)≤7个或基础卵泡刺激素(Folliclestimulating，hormone，FSH)≥10 U/L。③符合IVF适应症。排除标准：①有IVF禁忌症的患者。②有卵巢手术史、子宫畸形、子宫肌瘤、子宫内膜病变、卵巢囊肿患者。③既往有子宫卵巢手术及放化疗史患者。④夫妻双方任何一方染色体异常。本研究患者及家属均签署知情同意书。

1.2 方法 控制性促排卵方案(Controlled ovarian stimulation，COS)：①PPOS组于月经周期第2～3日起口服安宫黄体酮(醋酸甲羟孕酮，浙江仙琚制药)10mg/d至取卵后10 d，同时口服来曲唑(芙瑞，浙江海正药业股份有限公司)2.5 mg/d直到HCG注射日，根据患者卵巢储备及卵泡生长情况皮下注射尿促卵泡素(丽申宝，广州丽珠制药)。②长方案组：在前一个月经周期的黄体中期(月经第21～22日)单次皮下注射GnRH-a激动剂醋酸曲普瑞林(3.75 mg/支)1.25 mg，注射后14 d经阴道超声评价卵泡情况，当子宫内膜厚度小于5 mm，FSH<5IU/L,E2<50 pg/mL,LH<5IU /L时，给予尿促卵泡素(丽申宝，广州丽珠制药)至HCG注射日，促排卵期间根据卵泡大小和激素水平调整用药剂量。③拮抗剂组：月经周期的第2天行性激素水平检测及阴道超检查，评估患者卵巢储备功能，给予尿促卵泡素(丽申宝，广州丽珠制药)，监测卵泡发育情况并调整Gn用量，当主导卵泡直径达到14 mm时，皮下注射0.25 mg/d的促性腺激素释放激素拮抗剂(思则凯，默克雪兰诺，瑞士)，直至HCG注射日。启动剂量依据患者年龄、BMI、AMH及既往促排卵周期卵巢的反应性等因素综合考虑决定。取卵、胚胎移植及鲜胚黄体支持：当双侧卵巢有2～3个卵泡直径达到17～18 mm时，肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG，珠海丽珠医药)6000～10000 U，诱导卵泡成熟。HCG注射后35～37 h经阴道超声引导穿刺取卵抽吸14 mm以上卵泡，IVF进行受精(精液采用精子分离液密度梯度离心方法处理)，取卵后开始黄体支持，口服地屈孕酮(达芙通，10 mg)20 mg/日，同时黄体酮60 mg/d肌内注射，72 h后有可移植胚胎，排除宫腔、内膜及HCG日孕酮值升高等影响内膜容受性因素，给予移植2枚胚胎。PPOS组进行全胚冷冻。胚胎质量评判：卵裂期D3胚胎评分标准[8]：Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形状规则，无明显DNA碎片；
Ⅱ级：卵裂球大小略不均，形态略不规则，DNA碎片<20%；
Ⅲ级：卵裂球大小明显不均，DNA碎片20%～50%；
Ⅳ级：DNA碎片>50%。卵裂期优质胚胎定义为：D3胚胎评分为Ⅰ～Ⅱ级，卵裂球数为6～9枚。冻融胚胎移植(FET)及黄体支持：患者至少有2个D3可移植胚胎，根据患者不孕原因、月经情况等个体化选择内膜准备方案。自然周期：有正常排卵患者于月经8～9 d起监测排卵，排卵后给予口服地屈孕酮40 mg/日，3 d后在彩超阴道下进行胚胎移植。人工周期：月经2～3 d开始口服17β-雌二醇，4～6/mg，连服7 d后开始阴道超声监测子宫内膜厚度及形态，调整17β-雌二醇剂量，当内膜厚度达到8 cm以上，并口服药物时间达11 d以上，给予口服地屈孕酮40 mg/日，同时黄体酮凝胶90 mg/d阴塞转化内膜后在超声引导下移植胚胎。妊娠结果判断：胚胎移植后14 d采集患者空腹静脉血β-hCG，阳性者并于2周后B超检查见孕囊者确诊为临床妊娠，妊娠者监测至妊娠3个月，妊娠3个月内出现的流产为自然流产。观察指标：Gn天数和总量、注射HCG日E2、LH、P、直径≥1.4cm卵泡数，获卵数、MⅡ卵数、2PN受精数、优质胚胎数、早发LH峰等临床指标；
计算获卵率、正常受精率、优胚率、周期取消率、胚胎种植率、累积临床妊娠率、流产率指标。

2.1 3组患者一般情况比较 患者的年龄、BMI、不育年限、AFC、bE2、bFSH、bLH等观察指标在各组间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组患者一般情况比较Table 1 Comparison of the general information among the three groups

2.2 患者促排卵周期临床及实验室指标 3组中长方案组Gn的使用总量最高，且明显高于PPOS组和拮抗剂组(P<0.001)，长方案组使用Gn的天数也显著长于其他两组(P<0.001)。拮抗剂组和PPOS组的HCG日LH平均水平均高于长方案组，拮抗剂组最高，为长方案组的3.3倍,PPOS组次之，是长方案组的2.8倍,差异均有统计学意义(P<0.001)。HCG日P值在拮抗剂组和长方案组差异有统计学意义(P<0.05)。HCG日E2最低为PPOS组，其次为长方案组，拮抗剂组最高，前者明显低于后两组(均P<0.001)。卵泡直径≥1.4 cm最多的为拮抗剂组(M=5)，最少的为PPOS组(M=5)，拮抗剂组和长方案组均多于PPOS组，差异均有统计学意义(P<0.001)。PPOS方案组的MⅡ卵泡成熟度、2PN受精数及优胚数最低，长方案的MⅡ卵泡成熟度、2PN受精数和优胚数均高于其他两组，差异有统计学意义(均P<0.001)(见表2)。拮抗剂组的早发LH峰明显高于长方案组(P<0.05)。3组获卵率最高者为PPOS组，其次为长方案组，最低者为拮抗剂组，PPOS组获卵率显著高于拮抗剂组(P<0.001)。正常受精率拮抗剂组最高，其次是长方案组，均高于PPOS组(P<0.001)。长方案组的优质胚胎率最高达76.8%，拮抗剂组仅为62.3%，两组差异有统计学意义(P<0.001)。3组患者间周期取消率差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 3组患者促排卵周期临床及实验室指标比较[M(q25,q75)]Table 2 Comparison of clinical and laboratory indexes in ovulation stimulation cycle among the three groups

表3 3组患者促排卵周期临床及实验室指标比较Table 3 Comparison of clinical and laboratory indexes in ovulation stimulation cycle among the three groups

2.3 3组患者的妊娠结局 研究发现，在鲜胚移植中长方案组的妊娠率高于拮抗剂组，而拮抗剂组的鲜胚移植取消率高于长方案组，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在累积妊娠结局的比较，中长方案组的累积胚胎种植率高于拮抗剂组和PPOS组，长方案组与PPOS组比较差异有统计学意义(P<0.05)；
长方案组的累积临床妊娠率和累积活产率均高于拮抗剂组和PPOS组，但3组间差异无统计学意义(P>0.05)。3组患者的流产率差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 3组患者妊娠结局比较Table 4 Comparison of pregnancy outcomes among the three groups

年龄是影响女性IVF-ET临床结局的主要因素之一[9]。随着女性年龄的增长伴随卵子数目的逐渐减少，同时卵母细胞胞浆内过氧化反应增强，氧自由基增加[10-11]，导致卵母细胞质量下降，在胚胎分裂过程中染色体非整倍体率增加[12-14]，妊娠率降低，流产率也增加。

本研究应用3种不同促排卵方案对高龄卵巢低储备患者377个周期的临床实验室检查指标及临床妊娠相关结局进行评价，研究发现PPOS组的获卵率最高，其次为长方案组。然而，研究结果发现长方案组的MⅡ卵数、2PN受精数和优胚数均高于其他两组；
PPOS方案组的MⅡ卵数、2PN受精数及优胚数最低。说明虽然PPOS组的获卵率高，但该组的卵泡成熟度及正常受精数却不高，导致优胚数下降。所以，在高龄卵巢低储备人群中保障获取足够数量的成熟卵子将为成功妊娠奠定良好的先决条件。已有研究[15]发现，在辅助生殖促排卵过程中，当获卵数<15枚时，活产率随着获卵数的增加而升高。长方案组的降调节作用可以很好的抑制促卵泡生成素(Follicle Stimulation Hormone，FSH)，促进卵泡的同步发育，同时降调节作用也可以有效的抑制内源性LH峰，防止卵泡过早黄素化及早排的发生，这是提高卵母细胞质量和胚胎质量的重要条件[16]。

本研究中HCG日LH水平在拮抗剂组中最高，其次为PPOS组，长方案组最低；
相对应的呈现出了拮抗剂方案中的早发LH峰最多(5例)，其次为PPOS组(2例)，长方案组最低仅1例。研究再次提示长方案在抑制早发LH峰的作用中优于PPOS方案及拮抗剂方案。研究报道在正常卵巢储备患者中有0.34%～8.0%的患者使用拮抗剂方案抑制早发LH峰失败[17-18]。2015年Lefebvre等[19]研究表明，拮抗剂方案在卵巢低反应患者中不能改善获卵率及妊娠结局，即使增加Gn使用剂量也不能增加获卵数。拮抗剂方案的不足之处即为卵泡均一性较差，获卵率较低，尤其表现在高龄患者，这是由于在高龄卵巢低储备患者的前一周期的黄体后期即可有增高的FSH募集卵泡的生长，这使高龄卵巢低储备的患者卵泡早期就有较大卵泡的生长。而且该类患者在促排卵过程中容易发生早发LH峰，导致卵泡早排[20]，周期取消率高。

妊娠结局的比较中，长方案的鲜胚妊娠率和累积临床妊娠率均高于拮抗剂方案，长方案组的累积胚胎种植率高于拮抗剂方案组和PPOS方案组。但只有长方案和PPOS方案组胚胎种植率比较差异有统计学意义，其余组别比较无统计学意义，考虑可能与样本量较少有关。研究结果与Al-lnany[21]研究基本一致，发现长方案的临床妊娠率高于拮抗剂方案。此外，朱洁茹等[22]研究也证实长方案的胚胎种植率显著高于拮抗剂方案，尤其在年龄≥38岁和获卵数≤5的人群中差异更为明显。这可能的原因为长方案降调节后子宫内膜发生磷酸化和细胞因子调节作用，减少白细胞介素1和肿瘤坏死因子α等炎症细胞因子的释放，抑制子宫内膜炎症，改善宫腔环境，提高子宫内膜容受性[23-24]，从而提高临床妊娠率。考虑高龄患者更易出现卵泡发育异常及排卵障碍，在我中心的此类患者多选择人工周期解冻移植，虽然长方案的累积胚胎种植率、累积临床妊娠率和活产率都优于其他两种方案，一方面可能是有赖于长方案增加了可移植胚胎数，另一方面优化了子宫内膜环境。但无论是任何方案，高龄患者卵巢储备功能下降，卵母细胞质量降低均无法改善，所以，各组间的比较统计学差异并不明显。在本研究中，子宫内膜薄或回声不均和HCG日孕酮值的升高是取消鲜胚移植的主要原因，考虑拮抗剂有溶黄体作用[25]，并且高龄患者胚胎数量有限，所以拮抗剂方案的鲜胚移植取消率高于长方案，但两组差异无统计学意义。

此外，研究还发现长方案组Gn的使用总量最高，使用Gn的天数也显著长于其他两组。由于垂体降调节后降低了FSH，同时高龄妇女卵泡数量少，卵泡募集的阈值随之升高，对Gn反应性差，需要更高剂量及延长时间Gn的使用来改善卵泡的反应性是导致这一现象出现的主要原因[26-27]。尽管长方案促排卵时间略长，Gn使用剂量较多，但该方案和拮抗剂可以选择鲜胚移植，缩短了达妊娠时间(Time to pregnant，TTP)。而PPOS方案无法鲜胚移植，TTP明显长于其他两组，增加了患者的治疗费用和心理负担。鉴于此，高龄卵巢低储备人群在IVF -ET过程中是可以选择长方案获得较为理想的临床结局。

高龄卵巢低储备患者可以选择长方案作为辅助生殖技术的治疗方案之一，在治疗中可以获得更高的可移植胚胎数、鲜胚妊娠率和累积临床妊娠率。虽然本研究为高龄卵巢低储备人群在辅助生殖促排卵方案中进行了初步探讨，并提供了临床指导和借鉴，但本研究为局部地区的小样本回顾性研究，治疗方案的选择与医生的临床经验有一定关系，结果的验证性受到诸多尚未纳入到本研究的因素影响，因此开展多中心的大样本前瞻性研究将更加迫切。

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