槲皮苷对PCV2,感染猪肺泡巨噬细胞吞噬活性的影响

易首利，韦玉衡，赵 怡，匡 娜，曹永强，胡庭俊

（ 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005 ）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一。目前发现PCV有4个血清型，即猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）、猪圆环病毒Ⅲ型（PCV3）和猪圆环病毒Ⅳ型（PCV4）。PCV2为致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原[1]。随着养殖业快速发展，PCV2 病毒已在全球范围内广泛传播，通过水平传播和垂直传播两种方式在猪群中流行，对猪群造成持续性危害[2]，造成了巨大的经济损失。

黄酮类化合物是一类存在于天然物质中具有酚类结构的化合物，属于植物次生代谢产物[3]。大量研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏、抗氧化及抗癌等特性[4-5]。辣蓼的主要化学成分有黄酮类、挥发油、糅质类等，其中黄酮类化合物具有生物抗氧化性、清除自由基、杀虫等多种生物活性[6]。辣蓼黄酮主要含有芦丁、槲皮素和槲皮苷等物质[7-8]。槲皮苷（quercitrin，QUE）具有多种治疗作用，包括抗心脑血管疾病、免疫调节、神经保护、调节血脂及抗氧化等[9]。有研究结果显示，QUE 具有抗过敏作用，可减轻特应性皮炎[10]。董金叶等[11]发现，QUE可以通过减少吞噬细胞的数量减轻局部炎症细胞浸润，进一步减轻小鼠变应性鼻炎的症状。Kim 等[12]发现，QUE 通过刺激NADPH 的产生和线粒体膜电位增强真皮乳头细胞中的细胞活力和能量代谢，促进头发生长。Tang 等[13]发现，QUE 可以抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症和氧化应激。目前PCV2流行毒株变异较快，尚无较好的方法能够完全控制该病的发生。本试验采用中性红法测定QUE 对3D4/2 细胞吞噬活性的影响以及QUE 对感染PCV2 的3D4/2 细胞吞噬活性的影响，确定QUE 能否提高3D4/2 细胞的吞噬活性，并对其产生保护作用。

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂

QUE（纯度98%）购自北京索莱宝科技有限公司，DMEM 粉末高糖培养基、胎牛血清购自Gibco 公司，青霉素、链霉素混合液（100×）、L-Glutamine、PBS缓冲液、二甲基亚砜（DMSO）、中性红粉末购自索莱宝公司，胰蛋白酶EDTA溶液购自BI公司。

1.1.2 试验仪器

多功能微孔板检测仪（瑞士TECAN 公司）、荧光细胞计数分析仪（美国NEXCELOM公司）、二氧化碳培养箱（德国BINDER 公司）、TS100-F 倒置显微镜（日本Nikon公司）。

1.1.3 病毒和细胞

PCV2毒株由南京农业大学动物疫病诊断与免疫实验室馈赠，由本实验室在PK-15细胞上进行扩增培养获得病毒液，根据Reed-Muench方法测量其病毒滴度（TCID50）为10-5/0.1 mL。

猪肺泡巨噬细胞系3D4/2 细胞来自武汉大学细胞库，由本实验室扩增培养获得，定期复苏细胞保存活力，并于液氮中冻存。

1.2 试验方法

1.2.1 QUE 对3D4/2细胞吞噬活性的影响

将生长状态良好的3D4/2 细胞用10%-FBS-DMEM培养液调整浓度至1×105个/mL细胞悬液，按照100 μL/孔接种于96 孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中孵育2 h。待细胞长至单层后取出96 孔板，弃去培养液，按照100 μL/孔加入新鲜的2.5%-FBS-DMEM 完全培养液，置于细胞培养箱中培养12 h。

试验设置细胞对照组、0.05% DMSO 组和不同浓度的QUE 药物组（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol/L，以2.5%-FBS-DMEM 培养液稀释），每组6 个重复。细胞对照组、0.05% DMSO 组每孔加入200 μL 2.5% FBSDMEM 培养液，药物组每孔加入200 μL 不同浓度的槲皮苷，置于细胞培养箱中培养36 h。

培养结束前1 h，弃掉培养液，PBS洗涤细胞，每孔分别加入0.072%中性红溶液100 μL，置于细胞培养箱中作用1 h。取出96孔细胞培养板，弃掉中性红溶液，加入PBS 缓冲液洗涤细胞，吸取150 μL细胞裂解液分别加入每孔中，混匀后置于细胞培养箱中继续培养1 h，在酶标仪540 nm处下测定OD值，计算细胞吞噬指数。

1.2.2 QUE对PCV2感染3D4/2细胞吞噬活性的影响

试验设置为细胞对照组、0.05% DMSO 组、PCV2阳性对照组和不同浓度的QUE 药物组（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、 400.0 μmol/L，含2.5%-FBS-DMEM 培养液稀释），每组6 个重复。细胞对照组、0.05% DMSO 组每孔加入100 µL无血清的DMEM培养液，PCV2阳性对照组和不同浓度QUE 组加入PCV2（感染复数MOI=1）病毒液100 μL孵育2 h，用无菌PBS洗涤后，细胞对照组和对照组每孔分别加入200 μL 含2.5%-FBS-DMEM 培养液，QUE 组每孔加入200 μL 不同浓度的QUE 溶液，放入培养箱中继续孵育培养36 h。按照1.2.1中的中性红法测定其OD值，并计算吞噬指数。

1.3 数据处理与分析

试验数据采用SPSS statistics 23软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2.1 QUE对3D4/2细胞吞噬活性的影响（见表1）

由表1 可知，与对照组相比，0.05% DMSO 组、12.5 μmol/L QUE 组对3D4/2 细胞吞噬指数无显著增强作用（P＞0.05）；
25.0、50.0 μmol/L 的QUE 处理后显著提高了3D4/2细胞的吞噬指数（P＜0.05）；
经100.0～400.0 μmol/L的QUE处理后极显著提高3D4/2细胞的吞噬指数（P＜0.01）。

表1 QUE对3D4/2细胞吞噬指数的影响Tab.1 Effect of QUE on 3D4/2 cell phagocytosis index 单位：%

2.2 QUE 对PCV2 感染3D4/2 细胞吞噬活性的影响（见表2）

表2 QUE对PCV2感染3D4/2细胞吞噬指数的影响Tab.2 Effect of QUE on phagocytic index of PCV2-infected 3D4/2 cells单位：%

由表2可知，PCV2感染3D4/2细胞36 h后略下调细胞的吞噬指数，但与细胞对照组相比差异不显著（P＞0.05）；
含有0.05% DMSO 的溶剂对细胞吞噬指数也无显著影响（P＞0.05）。与PCV2 阳性对照组相比，不同浓度的QUE（12.5～400.0 μmol/L）处理36 h后均能够极显著提高PCV2感染3D4/2 细胞的吞噬指数（P＜0.01）。与对照组相比，100、200、400 μmol/L 的QUE 极显著提高细胞吞噬指数（P＜0.01）。

黄酮类化合物广泛存在于自然界中，属植物次生代谢产物，对细胞吞噬活性有一定影响，具有免疫调节作用。巨噬细胞的吞噬功能使其具有清除自身衰老细胞、杀灭外源性抗原及抗原提呈等作用[14]。巨噬细胞是一把双刃剑，在多种疾病中具有双重作用，是促发先天免疫的炎症反应的主要介质，通过分化、极化、激活等方式，对多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的发病机制起到决定性作用[15]。PCV2通过口鼻腔、呼吸道等途径感染天然宿主（家猪和野猪），病毒在宿主体内持续性复制增殖，诱导具有免疫抑制作用的细胞因子表达，进一步降低宿主细胞非特异性免疫功能，严重侵害患猪的免疫系统，形成免疫抑制。猪肺泡巨噬细胞通常被认为是PCV2 感染的重要靶细胞，是机体免疫系统抵御有害物质的第一道防线。吞噬活性增强是肺泡巨噬细胞活化的典型特征，也是衡量机体免疫功能强弱的重要指标。中性红法常用于检测免疫细胞的胞饮吞噬能力，其细胞数量的多少决定中性红的积累，与细胞胞饮吞噬活性呈正相关。

研究发现，大多数黄酮类化合物均可以促进巨噬细胞的吞噬作用，增强细胞的免疫功能[16-18]。苦荞糠皮总黄酮可使小鼠吞噬细胞的吞噬能力增强，且吞噬指数呈剂量依赖性增加[19]。杨秀松[20]发现，金花葵粗黄酮提取物可以增强小鼠巨噬细胞的吞噬百分率、单核吞噬细胞的吞噬指数。橙皮素衍生物通过增强巨噬细胞的吞噬作用，促进一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的释放，同时上调Bcl-2和Bcl-XL 蛋白的表达增强免疫力，从而参与免疫反应[21]。上述结论与本试验中QUE增强巨噬细胞吞噬活性的结果相一致。

本研究通过中性红试验检测3D4/2 细胞吞噬活性，结果表明，DMSO溶剂、12.5 μmol/L QUE对细胞吞噬指数无显著作用，即对吞噬活性无影响；
25.0～400.0 μmol/L 的QUE显著提高细胞的吞噬指数，即增强其吞噬活性；
12.5～400.0 μmol/L的QUE均能极显著提高PCV2感染3D4/2细胞的吞噬指数，即对其吞噬活性具有明显的增强作用，且吞噬活性随着药物浓度升高而增强。综上所述，QUE能够促进猪肺泡巨噬细胞的吞噬活性，并具有一定的保护作用，可增强细胞的免疫活性。

本研究结果显示，QUE可以显著提高3D4/2细胞吞噬中性红染料的能力，即QUE 提高3D4/2 细胞的吞噬活性，表明QUE 对3D4/2 细胞具有一定的保护作用与免疫调节作用，对其吞噬活性具有良好的促进作用。

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