前体mRNA剪接因子基因突变与视网膜色素变性的研究进展

汪晓晨，邴子钰，孔珺

(1.中国医科大学附属第四医院眼科，辽宁 沈阳 110005；
2.大连医科大学附属第二医院眼科，辽宁 大连 116023)

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种常见的遗传性视网膜变性疾病，主要特征为视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的进行性损伤和死亡，可导致患者周边视力逐渐丧失和夜盲，该病在全世界的患病率为1/5 000～1/3 000[1]，具有显著的临床异质性与遗传异质性。临床特点为夜盲、视野缩小和视网膜上出现骨细胞样色素沉着。RP可以分为综合征性RP和非综合征性RP。其中非综合征性RP具有遗传倾向，表现为常染色体显性遗传RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，adRP)、常染色体隐性遗传RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，arRP)、性连锁遗传RP(X-linked retinitis pigmentosa，xLRP)，此外还可以表现为线粒体遗传[2]。迄今为止，已鉴定出103个基因与非综合征性RP有关[3]。大多数的RP致病基因在光感受器细胞或RPE中表达，并参与光感受器细胞或RPE的功能，这类基因占据RP致病基因的绝大部分比例。但有一种类型的RP致病基因在全身组织表达，并参与前体mRNA的剪接，称之为前体mRNA剪接因子 (pre-mRNA processing factors，PRPFs)，包括PRPF3、PRPF4、PRPF6、PRPF8、PRPF31、SNRNP200、RP9和DHX38，这类基因发生突变却仅影响视网膜光感受器细胞的功能，目前机制尚不清楚。现就近几年来关于PRPFs功能及其突变引起RP的致病机制的研究进展进行综述。

真核细胞的前体mRNA剪接是内含子的剪切和外显子的拼接过程，是基因转录表达的第一步[4]。内含子必须从前体mRNA上精确地去掉，因为即使是单个核苷酸的错误也会导致开放阅读框移位或者非功能性蛋白质的产生。前体mRNA的剪接在剪接体中完成，剪接体是由包括U1、U2、U4、U6、U5在内的5种小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoprotein，snRNP)和一系列的辅助蛋白构成[5]，涉及100多种蛋白质和至少5条RNA分子。每种snRNP都是由一条小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)和与之特异性结合的七元环蛋白质复合物组成。剪接体需要进行两个催化步骤以完成前体mRNA内含子的剪切(图1)。首先是U1 snRNP和U2 snRNP辅助因子分别识别内含子5’端和3’端剪切位点，U2 snRNP识别内含子内部的分支点序列，形成剪接复合前体即复合物A[6]。U4/U6二聚体(U4/U6 di-snRNP)与U5 snRNP结合形成U4/U6-U5小核糖核蛋白三聚体(U4/U6-U5 tri-snRNP)后，加入复合物A形成无催化活性的复合物B。在多种RNA解旋酶包括Brr2、Snu114和Prp2及其他蛋白因子的参与下，复合物B发生重构活化，U4/U6 snRNA解旋，接着复合物B释放出U1和U4[7]，之后形成以U2、U5和U6为核心的具有催化活性的复合物B。

随后具有催化活性的复合物B进行第一个催化步骤形成复合物C。复合物C在Prpf8、Prpf16和Slu7的作用下进行ATP依赖性的重构活化后，进行第二个催化步骤，之后形成包含内含子套索和剪接的外显子的剪接后复合物。完成前体mRNA剪接后，剪接体解离至snRNP水平，并循环用于下一轮次的剪接[6]。

图1 前体mRNA剪接过程

随着对RP致病基因的深入研究，人们意识到前体mRNA剪接缺陷在RP病因学中占有重要地位，并对PRPFs的功能及其突变导致RP的分子机制进行了大量的研究工作。PRPFs广泛存在于真核细胞内，但关于此类基因缺陷导致视网膜组织特异性疾病的机制仍不清楚。以下对各个与RP相关的PRPF的功能及其引发RP的类型进行介绍。

2.1 PRPF3基因与RP18

PRPF3基因定位于染色体带1q21.1[8]，编码相对分子质量为77 529的PRPF3蛋白，该蛋白由683个氨基酸组成。在剪接过程中，PRPF3蛋白与U4/U6 di-snRNP结合[9]，并通过与PRPF6和Sart1的相互作用稳定U4/U6-U5 tri-snRNP[10-11]。研究表明，PRPF3突变会降低U4/U6-U5 tri-snRNP的稳定性，从而影响剪接过程[11]。PRPF3基因突变可导致RP18，RP18是一种adRP，目前发现的6个引起RP18的PRPF3错义突变包括Arg449Gly、Ala489Asp、Pro493Ser、Thr494Met、Thr494Ala、His511Pro[8，12-13]，均位于PRPF3蛋白在生物进化过程中高度保守的蛋白C端，表明PRPF3蛋白的这一区域在前体mRNA剪接过程中具有重要功能[8]。其中Thr494Met出现频率较高，有关Thr494Met-RP 的报道描述了患儿早期出现夜盲症、视野丧失，30～40岁视力下降以及30岁后视网膜电图(electroretinogram，ERG)为平坦型[14-16]。然而在瑞士家系中报道的两组Thr494Met-RP患者中，只有一组患者的表型与所述其他家族的表型相似，另一组患者在十几岁晚期、二十岁早期出现夜盲症，该组的所有患者即使在70岁之后也保持了良好的视力(最佳矫正视力0.8)。所有患者都有一定程度的近视和散光，丹麦家族的一些成员[16]和日本家族中描述的三名患者之一[14]也有报道。

2.2 PRPF4基因与RP70

PRPF4基因定位于染色体带9q32，编码相对分子质量为58 449的PRPF4蛋白，该蛋白包含522个氨基酸。PRPF4蛋白与PRPF3蛋白和PPIH蛋白组成的复合物参与构成U4/U6 di-snRNP及U4/U6-U5 tri-snRNP。Linder等研究显示，PRPF4缺陷可能导致RP，因为PRPF4蛋白的减少可以引起与PRPF31蛋白减少同样的眼部表型[17]。目前一共报道过4个引起RP的PRPF4错义突变，包括Arg192His、Pro315Leu、Pro187Ala、Thr515Ile[17-20]。

Arg192His突变可以影响PRPF4与PRPF3的相互作用及与snRNPs的结合[17]。PRPF4突变可导致RP70，RP70属于adRP。Chen等[19]报道的RP70家系及一名散发患者，出现夜盲的年龄在15～27岁，47～66岁出现夜间视力差、中心视力差、视野严重缩窄、典型的RP眼底表现以及几乎无法检测到的ERG反应。

2.3 PRPF6基因与RP60

PRPF6基因包含21个外显子，在染色体带上定位于20q13.33，编码的PRPF6蛋白相对分子质量约为106 925 ，包含941个氨基酸。PRPF6蛋白属于U5 snRNP相关蛋白，其作用是U5 snRNP和U4/U6 di-snRNP之间的分子桥梁，并参与U4/U6-U5 tri-snRNP的组成[11，21]。PRPF6突变可导致RP60。Tanackovic等[22]报道了第1个与adRP相关的PRPF6错义突变Arg729Trp，该突变位于PRPF6第16号外显子。该家系先证者在37岁时出现夜盲症和周边视力下降，55岁时右眼仅存手动视力，视野缩窄和全视野ERG振幅降低。家系中另一名受影响的个体在16岁时被诊断为RP，当时伴随夜盲症，40岁左右时丧失了周边视力，到54岁时，视力逐渐下降到只有双眼光感。同时研究发现含有Arg729Trp突变的PRPF6蛋白异常聚集在RP患者淋巴细胞的高尔基体中。高尔基体属于细胞器结构，是snRNP成熟、U4/U6-U5 tri-snRNP再生以及缺陷的snRNA堆积的部位[22-23]，所以这提示Arg729Trp突变可能会抑制snRNP的组装。随后研究者又发现了3个可导致RP的PRPF6错义突变Asp184His、Val499Met、Pro181Leu[18，24]，但关于这些突变的进一步研究工作未见报道。

2.4 PRPF8基因与RP13

PRPF8基因位于17p13.3，编码相对分子质量为273 600 的PRPF8蛋白。PRPF8蛋白是目前已知的最大的且最为保守的核蛋白之一，由2 335个氨基酸组成。PRPF8蛋白是占据U5核心的蛋白因子，几乎参与了U5 snRNP所有的功能，包括剪接位点和分支区域的识别、U4/U6-U5 tri-snRNP的组装和稳定、外显子比对以及剪接体催化核心的活化[25]。PRPF8蛋白与U5 snRNA以及包括BRR2、SNU114在内的多种参与剪接的蛋白存在相互作用[26-27]。PRPF8突变可导致RP13，目前已经发现与RP13相关的PRPF8突变已超过20个，这些突变多数集中在编码Jabl/MPN区域的43号外显子[21，28-29]，而该区域参与Brr2的解旋[30]。既往研究认为，PRPF8突变导致的adRP表型是相对严重的，而且发病年龄区间变化较大[31-32]。然而，Towns等[33]在对RP表型和基因型相关性的研究中提出了不同的看法，在比较了 75名PRPF8-adRP患者的临床数据后，研究人员发现尽管这些RP患者周边视力丧失严重，但大多数患者在发病后几十年内保持了良好的中心视力水平。

2.5 PRPF31基因与RP11

PRPF31基因定位于染色体带19q13.42，共有14个外显子，编码相对分子质量55 456的PRPF31蛋白，该蛋白由499个氨基酸组成。PRPF31蛋白是U4 snRNP组成的一部分，它与U5特异蛋白PRPF6相连以形成tri-snRNP[34]，并维持其稳定性。PRPR31突变可导致RP11，RP11的一个特点是PRPF31基因突变的双峰表达，即携带PRPF31基因突变的个体可能完全无症状，也可能在早期即表现出严重的表型。无症状携带者可同时拥有患有RP的父母及子女[35-36]。有症状的个体表现为在青少年时期出现早发性夜盲和视力丧失，通常在30岁左右时失明[37]。与RP11相关的突变多发生于PRPF31基因第5号、6号、7号、8号外显子区域，突变类型包括错义、缺失、移位、插入，多数突变导致的是其mRNA的截短，从而导致PRPF31蛋白功能不全，因此单倍体功能不全被认为是PRPF31突变引起RP的主要原因[38-39]。

2.6 SNRNP200基因与RP33

Zhao等[40]报道了在一个中国adRP家系中一个新的基因座RP33，其定位于染色体带2q11.2，随后的研究在两个中国adRP家系中分别鉴定了SNRNP200的错义突变Ser1087Leu[41]和Arg1090Leu[42]。SNRNP200由45个外显子组成，编码相对分子质量为244 508的BRR2蛋白。BRR2蛋白包含2 136个氨基酸，是剪接体中8种ATP依赖的DExD/H盒RNA解旋酶之一[43]，属于U5特异性蛋白。BRR2在剪接体激活过程中参与U4/U6 snRNA解旋[44]，其解旋酶活性由PRPF8 蛋白C端及SNU114的GTP酶活性调控[30，45]。每个BRR2蛋白含有2个Hel308式模块(Hel308-Ⅰ和Hel308-Ⅱ)，每个模块又包括1个DExD/H盒的ATP酶结构域以及个1个Sec63结构域[46]。Hel308-Ⅰ模块具有解旋酶的活性，Hel308-Ⅱ模块被证实与多个剪接体组成蛋白存在相互作用，如PRPF8、PRPF6和SNU114[11]。而SNRNP200的错义突变在两个模块结构域上均有被发现[41-42，47-48]。Zhao等[40]报道的由SNRNP200基因突变引起的RP33家系有症状的个体在16～18岁时出现夜盲症。Liu等[41]研究的RP33家系中夜盲症是主要症状，发病年龄在10～15岁。Li等[42]报道的RP33家系发病平均年龄为7～8岁，也有一些个体受影响的时间稍晚，在10～11岁。受影响的个体出现视野变窄、夜盲、视力下降、眼底照片显示RP的典型变化，同时视野随着年龄的增长而逐渐缩小，最终导致周边视力丧失，中心视力相对保留。这些研究提示RP33的发病年龄多在青少年时期。

2.7 RP9/PAP-1基因

RP9(又称PAP-1)基因定位于染色体带7p14.3，编码的蛋白质RP9由221个碱基组成，相对分子质量为26 107，是Pim-1激酶作用的靶蛋白[49]。Maita等[50]研究显示，RP9蛋白和PRPF3蛋白存在相互作用并且与U4/U6-U5 tri-snRNP存在联系，但是其他关于snRNP组成的研究中并没有在U4/U6 di-snRNP或U4/U6-U5 tri-snRNP中观察到RP9蛋白[51]。RP9基因突变导致的adRP是一种罕见疾病，1992年在一个英格兰南部的adRP家系中被报道，该家族成员的表型在严重程度上表现出广泛的差异性，一些应致病患者却没有表现出症状[52]。RP9基因突变导致的RP被归类为区域型(2型)RP，在疾病早期即出现视杆细胞和视锥细胞功能的片状或“区域性”丧失[53]。Keen等[54]报道了两个与adRP相关的RP9错义突变，分别为His137Leu和Asp170Gly。之后的研究显示，只有Asp170Gly突变可以引起剪接缺陷[55]。值得注意的是，在同一染色体位置上存在RP9的假基因，两个不同的研究显示，RP9的假基因突变既可以导致His137Leu[56]，又可以导致Asp170Gly[57]。Lv等[58]在体外661W细胞中进行Rp9基因敲除和Rp9点突变His129Leu(与人His137Leu86同源)敲入，均发现了Fscn2和Bbs2表达下调，同时发现Fscn2剪接受到了显著影响。FSCN2蛋白是一种肌动蛋白交联蛋白，在视网膜光感受器细胞内外段表达，对于光感受器细胞外节膜盘的形态发育起到重要作用。

2.8 DHX38基因与RP84

DHX38基因位于染色体带16q22.2，包含26个外显子，编码ATP酶依赖的RNA解旋酶——PRP16。PRP16蛋白属于DExD/H盒蛋白家族，其相对分子质量为140 503，由1 227个氨基酸构成，在剪接过程中可触发复合物B的重构[59]。在酵母菌的研究中发现，与人DHX38同源的Prp16p在剪接过程中可以与十九号复合物及Brr2p相互作用[60-61]。而PRP16蛋白在十九号复合物介导的U2/U6解旋中发挥重要作用[62]。DHX38突变可导致RP84，RP84是一种早发型的arRP。Ajmal等[63]在一个巴基斯坦arRP家系中发现了第1个DXH38错义突变Gly332Asp，Latif等[64]发现了第2个DXH38错义突变Arg324Gln，这两个突变均位于PRP16蛋白N端，推测Gly332Asp和Arg324Gln可能导致PRP16蛋白的错误折叠，从而影响剪接体的重构。RP84患者大部分在3～4岁即发生夜盲，青少年时即完全失明(光感或无光感)，Latif等报道的两个家系中的RP84患者发生白内障年龄为6～19岁[63-64]。

自从 Berget 等[65]首次观察到前体 mRNA 剪接反应以来，多种细胞和动物模型已被用于研究剪接体机制、疾病相关剪接缺陷和治疗。从单细胞酵母到哺乳动物系统，如小鼠和非人类灵长类动物，多种实验室疾病模型大大扩展了研究者对前体mRNA剪接机制及其导致RP的致病机制的认知，现将逐一进行讨论。

3.1 酵母模型

前体mRNA剪接在进化过程中高度保守，在酵母和后生动物中，剪接体组装和RNA剪接反应步骤相似，因此在酵母中关于前体mRNA剪接因子的研究可以推广到包括人类在内的多细胞真核生物中[66]。PRP3是PRPF3的酵母同源物。在对温度敏感的酵母菌株的筛选中发现PRP3突变体存在未剪接的前体mRNA的积累，表明Prp3蛋白功能障碍可导致剪接体组装受阻[67]。携带PRP6(人类PRPF6同源物)突变位点的温度敏感菌株在37 ℃时显示出灭活的RNA剪接[68]。通过对剪接缺陷酵母菌株进行温度敏感筛选，研究者鉴定了PRPF31直系同源物PRP31，发现其对细胞活力的重要作用[69]。Prp8/PRPF8是从酵母到人都高度保守的前体mRNA剪接因子。酵母双杂交系统分析证实了 Prp8和 Brr2(人类 RNA 解旋酶 SNRNP200 的酵母同源物)之间的相互作用，而这种相互作用被 Prp8 蛋白C端的RP突变中断[70]，从而减少了细胞核中功能性 U5 snRNP 和 U4/U6-U5 tri-snRNP 的形成[41]。酵母系统是筛选剪接因子、研究剪接体成分之间的相互作用以及剪接因子突变对剪接体组装和 RNA 剪接反应的影响的理想选择。然而，酵母细胞的特征与人类视网膜细胞显著不同，因此无法完全模拟PRPF-RP 疾病表型。

3.2 斑马鱼模型

斑马鱼与人类基因同源性高达87%，而其主要组织和器官包括眼睛与人类特征相似。斑马鱼发育周期短，繁殖快，一次可产卵150～200个，可在短时间内提供许多实验标本。通过显微注射 DNA 或 RNA 可轻松实现斑马鱼的基因改造[71]，既往已有多个prpf-RP斑马鱼模型被建立。斑马鱼prpf3纯和敲除可导致其在受精后4 d死亡，在敲除的胚胎中发现发育中的眼睛发生细胞死亡的水平升高，而在prpf3杂合敲除斑马鱼中未观察到发育异常或视网膜变性，这表明 RP18 是由prpf3错义突变引起的显性负效应引起的[72-73]。Linder等[74]在prpf4KD斑马鱼模型中发现，抑制prpf4表达可导致光感受器形态和功能变化。除此之外，prpf4Arg192His、prpf4Pro315Leu的斑马鱼模型提示prpf4突变可以导致胚胎和视网膜缺陷[17，19]。Prpf31蛋白对于斑马鱼胚胎存活和眼睛发育至关重要。应用吗啉代寡核苷酸沉默prpf31会导致严重的胚胎畸形和死亡。敲除prpf31主要影响视网膜感光外段并损害视觉功能，表现为视动性眼球震颤显著降低，严重者甚至没有扫视运动[75]。基因表达分析提示一组视网膜特异基因，如rho、gnat2和pde6c，在prpf31突变体中选择性下调，这可能导致了视网膜的特异性表型。敲低snrnp200可导致斑马鱼视网膜的系统缺陷，其中杆状光感受器的发育不良类似于RP发病的早期改变，此外snrnp200敲低诱发了cbln1的异常剪接、U4/U6-U5 tri-snRNP组分的上调以及一系列视网膜特异性转录产物的下调，推测SNRNP200突变导致RP的机制为基因功能丧失[75]。而Zhang等[76]将注射snrnp200c.C6088T(与人Arg2030Cys同源)的斑马鱼模型与注射snrnp200WT的斑马鱼模型进行对比，注射snrnp200c.C6088T的斑马鱼中出现了更高比例的大体畸形和光感受器细胞的丢失，因此推测该突变位点导致RP的机制为显性负效应。

3.3 小鼠模型

小鼠是哺乳动物，在进化上更像人类，因此通常用作人类疾病的模型。纯合/杂合敲入/敲除小鼠模型为研究Prpf-RP的致病机制提供了平台。Prpf3和Prpf31纯和敲除对小鼠胚胎是致命的，而在杂合敲除小鼠中未观察到光感受器变性或视网膜功能障碍[75，77]。携带Prpf3T494M/+和Prpf8H2309P/+突变的转基因小鼠表现出迟发性RPE退行性形态，包括基底部细胞膜内褶消失、RPE下方无定形沉积物积聚和细胞质空泡化。而这些RPE异常在Prpf3T494M/T494M和Prpf8H2309P/H2309P小鼠中更为严重，这表明 RP18和 RP13 是由Prpf3和Prpf8突变的功能获得或显性负效应引起的[78-79]。研究者在Prpf31杂合敲除小鼠中也观察到这种表型。此外，将截短的Prpf31突变体N371或N256转染到原代小鼠视网膜细胞中会导致显著的细胞凋亡[80]。因此，单倍体不足和显性负效应都可能是PRPF31突变致病机制的基础。吞噬光感受器细胞脱落的外节盘膜(outer segment of photoreceptors，POS)是RPE的关键功能之一[81]。Prpf31+/-小鼠的原代RPE细胞的吞噬作用显著降低，表现为吞噬峰强度下降、昼夜节律改变、光发后吞噬爆发减弱以及吞噬峰时间延长。RPE顶端微绒毛与POS之间的黏附显著降低，表明神经视网膜和RPE的整体功能受到干扰[79]。尽管突变型小鼠RPE存在形态学变化和功能缺陷，但其光感受器细胞在组织学和超微结构分析中似乎正常，仅在24个月时，Prpf3T494M/T494M小鼠出现视杆细胞最大反应a波和b波减少，但视锥细胞b波没有显著变化。这些研究表明，RPE是Prpf突变影响的原发性视网膜细胞类型，而光感受器细胞功能障碍继发于RPE损伤。

目前尚不清楚为什么Prpf突变小鼠只表现出RPE退化，而不是光感受细胞死亡，而这点正是人类PRPF-RP的关键表型。表型变异可能是由小鼠和人类之间的物种差异引起的，啮齿动物和人类视网膜之间存在基本的结构和功能差异。同时因小鼠的寿命太短，因此无法重现光感受器细胞退化的RP表现。

联合应用遗传、分子和生化等多种技术手段，促进了对遗传性视网膜疾病致病机制的进一步了解。而既往关于PRPF-RP的研究，突出了转录后RNA加工的重要性，尤其是前体mRNA剪接对维持光感受细胞正常功能的重要性。RP-PRPF突变可导致光感受器细胞的丢失，提示光感受器细胞可能具有独特的特性，使得他们对PRPFs的突变特别敏感。这也表明可能存在一个共同的途径，前体mRNA剪接缺陷通过该途径可导致光感受器细胞的死亡。

由于PRPF-RP的致病基因数目多、突变类型多样，目前仍有许多问题有待解决，进一步研究PRPF-RP的发病机制有助于开发治疗RP的新疗法，具有重要的科学价值和社会意义。

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