PYCR1在肝癌中的表达特点及其临床价值

张丽红 胡良峰 杨 烨 王宏斌

肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一。据报道，肝癌病死率位列恶性肿瘤的第3位，严重威胁着人们的健康[1]。肝癌早期症状不明显，且缺乏有效的早期诊断指标，大多数患者发现时已是晚期，失去了最佳治疗机会。早发现、早诊断、早治疗是改善患者生活质量，降低病死率的关键[2]。目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查和血清学肿瘤标志物，但是影像学检查往往难以准确地判断微小病灶，而目前临床常用的甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体等肝癌标志物敏感度均较低，很难准确筛选出早期肝癌[3, 4]。因此，探讨肝癌发生、发展机制，筛选出新的肝癌标志物及治疗靶点用于肝癌的诊断和治疗，具有重要的科学意义。PYCR1是吡咯啉-5-羧酸还原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase, PYCR)的3种同工酶之一，是一种广泛存在于人和动物体内的管家基因[5]。PYCR1在骨骼、脂肪和结缔组织的发育过程中起重要作用，基因突变会导致皮肤及骨骼系统异常，引起人类皮肤松弛症[6]。近年来研究证实，PYCR1与恶性肿瘤的发生、发展关系密切[7, 8]。本研究主要检测PYCR1在肝癌组织及患者外周血中的表达情况，评价PYCR1对肝癌的临床价值。

1.临床标本：收集笔者医院2019年6月～2021年12月经病理诊断为肝癌的患者肿瘤组织41例(其中肝细胞肝癌29例、肝内胆管细胞癌10例、混合型肝癌2例)、正常肝组织25例、血清标本58例(其中肝细胞肝癌39例、肝内胆管细胞癌16例、混合型肝癌3例)，所有患者均为原发性肝癌(转移性肝癌患者不纳入)；
另收集同期肝良性疾病患者血清34例(其中包括肝血管瘤16例、肝脓肿8例、增生性病变7例、肝硬化3例)。组织标本采用10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4μm厚切片，4℃保存；
外周血标本3ml入真空采血管，3500r/min离心5min，收集血清，分装后于-20℃保存。本研究经绍兴市人民医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号：2019-K-Y-189-01)，并由患者和(或)监护人签署知情同意书。

2.主要试剂：兔抗PYCR1单克隆抗体(ab279385)购自英国Abcam公司；
PYCR1蛋白ELISA检测试剂盒(MM-60192H1)购自江苏酶免公司。

3.生物信息学数据库分析PYCR1在肝癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系：利用GEPIA在线数据库分析PYCR1在肝癌与正常肝组织中的表达情况，以正常组织为对照，选择差异表达倍数>2，且P<0.001的结果。利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析肝癌组织中PYCR1表达水平及其与患者总生存期的关系，以PYCR1表达的中位数为cut-off值，对肝癌患者PYCR1表达水平与总生存期的关系进行生存分析。

4.免疫组化SP染色方法检测肝癌及正常肝组织PYCR1：使用PYCR1单克隆抗体试剂盒。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4℃冰箱中过夜，PBS缓冲液振荡清洗后分别滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，常规封片。结果判定：在高倍镜下每张切片选择5个有代表性的视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计数500个细胞，PYCR1定位于胞质、胞膜或胞核，出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞比例≥5%判断为阳性，<5%判断为阴性。

5.ELISA法检测血清PYCR1蛋白：将标准样品和患者样品(1∶5稀释)各50μl加入96孔板，37℃温育30min，洗板，加入酶标试剂50μl，37℃温育30min，洗板，依次加入显色剂A、B各50μl，37℃避光显色10min，每孔加终止液50μl，在450nm波长下测量各孔吸光度(A)值。每块板均以试剂盒提供的标准品浓度与实际所测的A值绘制标准曲线，并计算出标准曲线的直线回归方程，将样品的A值代入方程式，计算出样品浓度，进行板间差异校正。

6. 统计学方法：应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料以例数(百分比)[n(%)]表示，不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M(Q1,Q3)]表示，组间差异比较采用非参数检验中的Mann-WhitneyU检验，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

1. 生物信息学数据库分析结果：PYCR1在肝癌组织中的表达明显高于正常肝组织(P<0.05)，见图1A；
PYCR1高表达的肝癌患者预后较低表达患者差(P=0.0085)，见图1B。以上结果提示PYCR1在肝癌组织中表达升高，且其表达水平与患者预后相关。

图1 生物信息学数据库分析结果A.PYCR1在肝癌组织中的表达高于正常肝组织；
B.PYCR1高表达的肝癌患者预后较差(P=0.0085)

2.PYCR1在肝癌组织中的表达：本实验共检测41例肝癌组织和25例正常肝组织PYCR1表达情况，PYCR1在肝癌组织中的表达主要呈胞质分布，偶见胞膜、胞核分布，阳性信号为黄色或棕黄色颗粒(图2中A、B)；
PYCR1在绝大多数正常肝组织中不表达(图2中C、D)。采用χ2检验比较组间表达差异，见表1。由表1可以得出，肝癌组织PYCR1表达(25/41，61.0%)明显高于正常肝组织(1/25，4.0%)(χ2=21.116，P<0.001)；
PYCR1的表达水平与患者年龄、性别无关(P均>0.05)。

图2 免疫组化实验检测PYCR1在肝癌组织及正常肝组织中的表达A、B.PYCR1在肝癌组织中表达；
C、D.PYCR1在正常肝组织中不表达。A、C.×100；
B、D.×400

表1 肝癌及正常肝组织PYCR1的表达情况比较

3.PYCR1蛋白在肝癌患者外周血中的表达：本实验共检测58例肝癌和34例肝良性疾病患者血清PYCR1水平，两组人群PYCR1浓度资料均不符合正态分布，采用非参数检验中的Mann-WhitneyU检验比较组间各指标差异，肝癌组PYCR1蛋白水平明显高于肝良性疾病组(P=0.001，表2)；
肝癌患者PYCR1蛋白水平与年龄、性别无关(P值分别为0.851、0.837)。绘制血清PYCR1蛋白诊断肝癌的ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)，选择约登(Youden)指数最大处为最佳筛查阳性界值(cut-off值)，得到PYCR1诊断肝癌的cut-off值为102.1pg/ml，AUC为0.711，敏感度为79.3%，特异性为64.7%，详见图3。

表2 肝癌与肝良性疾病患者血清PYCR1水平比较[M(Q1,Q3)]

图3 PYCR1诊断肝癌的ROC曲线

吡咯啉-5-羧酸还原酶是一种线粒体酶，广泛存在于人体各种组织细胞中，在脯氨酸生物合成的过程中具有重要作用。人类PYCR存在3种同工酶，即PYCR1、PYCR2和PYCRL，其中PYCR1位于染色体17q25.3，含319个氨基酸，是一种多聚蛋白复合物，有活性的PYCR1是由5个相同的二聚体形成的环状结构，这5个二聚体形成一个圆形凹槽，是辅因子和底物的结合位点[9]。PYCR1基因缺陷可导致成纤维细胞中的线粒体膜电位发生改变，使线粒体网络破坏及氧化过程中的凋亡率增加。PYCR1是脯氨酸代谢中的关键酶之一，能在NAD(P)H的作用下，催化吡咯啉-5-羧酸(pyrroline-5-carboxylate, P5C)转化为脯氨酸，并可逆向转化哌啶-6-羧酸生成哌可酸[10]。

脯氨酸是细胞微环境中最丰富的氨基酸之一，它在细胞的应激保护和维持氧化还原平衡中起着关键作用[11，12]。此外，从细胞外基质的胶原降解而来的脯氨酸，也提供ATP以满足细胞的能量需求，在缺氧或低血糖的情况下，脯氨酸的利用有助于ATP的生成，还可以促进活性氧的生成而引起细胞自噬。因此，脯氨酸的合成和代谢对肿瘤的发生、发展具有重要意义[13，14]。脯氨酸主要通过其代谢过程中的两个关键酶影响肿瘤发生、发展：脯氨酸脱氢酶/脯氨酸氧化酶(PRODH/POX)和PYCR1。其中PRODH/POX具有诱导抑癌基因p53的作用，能抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，从而起到抑制肿瘤发生、发展的作用[15，16]。PYCR1作为脯氨酸代谢的另一关键酶，主要通过生物合成脯氨酸进而影响肿瘤细胞的生长发育，是原癌基因c-Myc的靶点，具有抗细胞凋亡和抗氧化功能[17，18]。近年来，PYCR1与恶性肿瘤形成的关系逐渐受到国内外研究者的广泛关注，已有研究者在直肠癌、胃癌等恶性肿瘤的组织中检测到了高水平的PYCR1，并证实PYCR1的高表达有助于肿瘤的侵袭转移，但PYCR1在肝癌中的研究较少[19～22]。

笔者所在的课题组利用生物信息学数据库分析发现，PYCR1在肝癌组织中的表达高于正常肝组织，且PYCR1高表达的患者预后较低表达患者差，提示PYCR1在肝癌的临床诊断和预后判断中可能具有一定的作用。笔者所在的课题组进一步收集了肝癌患者肿瘤组织和外周血标本进行PYCR1表达水平的检测，发现肝癌组织PYCR1表达高于正常肝组织，且其表达水平与患者年龄、性别无关；
肝癌患者血清PYCR1水平高于肝良性疾病患者，其表达水平与患者年龄、性别无关。以上结果与生物信息学统计结果一致。为了明确PYCR1对肝癌的诊断价值，笔者绘制了ROC曲线，发现PYCR1诊断肝癌的cut-off值为102.1pg/ml，AUC为0.711，敏感度为79.3%，特异性为64.7%。虽然ROC曲线结果显示，PYCR1诊断肝癌的特异性不高，但其敏感度较高，对肝癌的诊断具有一定辅助诊断价值，尤其是针对AFP阴性的肝癌，更具价值。但是本实验纳入病例较少，无法进一步分析PYCR1的表达水平与肝癌病理分型、临床分期等临床病例资料的关系，还需进一步扩大样本量进行相关研究。

综上所述，肝癌组织及外周血PYCR1表达水平对肝癌具有一定的临床价值，可以作为潜在的肝癌诊断及预后标志物，血清PYCR1具有采样方便、损伤小等优点，更具临床价值。随着检测方法学的改进及标准化，PYCR1有望大规模应用于临床肝癌的诊疗，然而PYCR1在肝癌发生、发展过程中的具体作用及机制尚不清楚，值得更深入研究。

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