补体C3调控细胞凋亡抑制咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮肤炎症反应

郑权友，杨奕，梁申菊

银屑病(psoriasis)是一种炎症性皮肤病，其典型病理表现为免疫炎症细胞浸润、真皮毛细血管增生紊乱、角质形成细胞异常增殖及分化不良等[1]。免疫炎症反应介导银屑病病理过程，角质形成细胞-免疫细胞相互作用促进银屑病进展[2]。补体系统是天然免疫的重要组分，包含多种表面分子、可溶性蛋白及诸多受体，在促进炎症反应、清除病原体及损伤细胞、调节适应性免疫应答等过程中发挥重要作用[3]。

补体C3是补体系统的枢纽分子：补体系统由经典、凝集素及旁路途径活化，形成C3裂解酶，裂解C3分子并活化下游补体成分，最终形成攻膜复合物介导细胞损伤及多种活性成分参与免疫应答[4]。皮肤组织中，角质形成细胞是补体C3的主要来源，C3参与调节多种皮肤疾病病理过程，包括特应性皮炎及银屑病[5]。然而，补体C3在银屑病中的作用及机制尚不完全明确。

IMQ乳膏局部涂抹是一种常用银屑病皮炎动物模型，其主要依赖于IMQ激活Toll样受体7(TLR7)及其他信号通路[6-7]。该病理过程中IMQ可诱导角质形成细胞凋亡及坏死，并释放大量炎症因子，如IFN-γ、IL-1、核酸及S100A8/A9等，激活皮肤炎症反应[8]。补体分子，如C1q及C3，在清除凋亡细胞过程中发挥重要作用[9-10]。研究[11]表明，凋亡细胞清除障碍可导致炎症反应异常活化促进多种自身免疫疾病病理过程，包括银屑病。据此，笔者推测补体C3可通过调节凋亡细胞清除在IMQ诱导银屑病皮炎病理过程中发挥重要作用。

本研究拟利用IMQ诱导银屑病皮炎模型，探讨补体C3通路在银屑病病理过程中的作用及机制，结果报告如下。

1.1实验小鼠 C57B6/L野生型(C3+/+)对照小鼠购自北京华阜康生物技术有限公司。C3基因敲除小鼠(C3-/-，C57B6/L背景)购自美国Jackson实验室。实验操作及动物伦理严格依据第三军医大学伦理委员会制定的动物伦理规范执行。

1.2实验材料 5%咪喹莫特乳膏(明欣利迪，H20030128，成都)；
Z-VAD-FMK、抗荧光淬灭封片剂、抗小鼠Cleaved cap3(Ccap3)/Cyt C/BAK抗体(上海碧云天生物技术公司)；
DMSO溶液、Hoechst 33258、Ⅳ型胶原酶、DNA酶Ⅰ、pyromellitic acid及ionomycin(Sigma公司)；
抗小鼠CD3、CD4 及C3(Santa Cruz)；
抗小鼠Ly-6G、F4/80(Abacm)；
HRP标记二抗、DAB(北京中杉金桥生物技术公司)；
Cell MeterTMApoptosis Assay Kit(ATT Bioquest®, Sunnyvale, CA, USA)；
TruStain fcX antibody、荧光标记抗小鼠CD45、Gr-1、CD3及CD4(BioLegend)；
抗小鼠Ki67、Brefeldin A、Fixation-Permeabilization kit及APC-IFN-γ(eBioscience)；
1640 完全培养基(Hyclone)。

1.3银屑病模型建立 取8～12周龄雌性C3+/+及C3-/-小鼠各5～6只，实验前1 d刀片刮除小鼠背部毛发备皮(大小约为2.0 cm× 3.0 cm)，实验组(IMQ组)用50 mg 5%咪喹莫特乳膏均匀涂抹小鼠背部皮肤，1次/d,连续5 d，对照组(Control组)用凡士林乳膏涂抹背部皮肤相同次数。凋亡阻断实验中，在IMQ 涂药前2 h C3-/-小鼠腹腔注射Z-VAD-FMK(10 mg/kg)或者等体积10% DMSO溶液，其余方法同前。每次涂药前及实验结束后用数码相机进行拍照，根据临床银屑病评分标准双盲法半定量分析小鼠银屑病样皮肤炎症程度。

1.4组织病理分析 涂药5次后于第6天，脱颈处死小鼠，收集其背部皮肤组织，4%多聚甲醛固定。石蜡包埋切片(4 μm)，HE染色明确其皮肤组织病理改变。IHC检测角质形成细胞增殖、T细胞、中性粒细胞及巨噬细胞浸润，详细方法如下：切片脱蜡水化，柠檬酸缓冲液微波高温抗原修复20 min，自然冷却，3%H2O2孵育20 min去除内源性过氧化物酶，5%BSA室温封闭1 h后，加入抗小鼠Ki67(1∶100)、CD3或者CD4(1∶200)、Ly-6G(1∶200)、F4/80(1∶200)、C3(1∶200,)、Ccap3/Cyt C/BAK(1∶100)抗体4 ℃冰箱孵育过夜。次日，PBS溶液洗去未结合抗体，HRP标记二抗(1∶800)室温孵育1 h，加入新鲜配制DAB溶液显色2 min左右，苏木素染液复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜(Olympus, Tokyo)观察组织中Ki67、CD3/4、Ly-6G及F4/80阳性染色情况。随机选择5～6个高倍镜视野半定量统计分析切片中上述蛋白阳性染色细胞数。

1.5细胞凋亡检测 石蜡包埋切片(4 μm)，脱蜡水化，根据Cell MeterTMApoptosis Assay Kit 提供说明检测组织细胞凋亡情况。Hoechst 33258(5 μg/mL)室温孵育10 min标记细胞核，抗荧光淬灭封片剂封固后于荧光显微镜(Leica Microsystems, Germany)下检测，并用Image J软件(NIH, Bethesda, MD, USA)对阳性细胞数进行半定量评分。

1.6流式细胞检测(FCM) 各组小鼠涂药5次后于第6天，脱颈处死小鼠，收集其背部皮肤组织及右侧腋窝引流淋巴结，制备皮肤及淋巴结单细胞悬液用于后续FCM实验。步骤如下：眼科剪剪碎背部皮肤组织(1 cm×1 cm)，用含Ⅳ型胶原酶(2 mg/mL)及DNA酶Ⅰ(200 U/mL)的1640培养基37 ℃孵育箱中消化1 h，含5% EDTA的 BSA溶液终止消化。70目筛网过滤2次制备皮肤单细胞悬液备用。腋窝淋巴结取出后，取适当大小组织团块70目筛网轻柔碾磨过滤制备单细胞悬液备用。细胞表面染色：单细胞悬液(1×106个/mL)，TruStain fcX antibody(2 μL/test)冰上孵育20 min封闭，加入荧光标记抗小鼠CD45、Gr-1、CD3及CD4(1 μL/test)冰上避光孵育25 min，流式洗液(含1% FBS的PBS)清洗2次后上机检测(BD FACS Canto Ⅱ)或进行胞内因子染色。胞内因子IFN-γ检测：制备好的皮肤或淋巴细胞悬液以含50 ng/mL pyromellitic acid, 500 ng/mL ionomycin和3 μg/mL Brefeldin A的1640 完全培养基(含10% FBS, 100 μg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin, 2 μmol/L glutamine, 50 μmol/L β-mercaptoethanol)37 ℃ 刺激4 h。细胞表面染色后，Fixation-Permeabilization kit固定通透细胞，加入IFN-γ(1 μL/test)抗体冰上染色25 min。流式洗液清洗2次后上机检测(BD FACS Canto Ⅱ)，运用Flow Jo软件分析所得数据。

2.1C3基因缺陷明显加重IMQ诱导慢性银屑病样皮肤炎症反应 IMQ可诱导C3+/+小鼠出现银屑病皮炎典型表现，如鳞屑、红斑及皮肤增厚；
与C3+/+组相比，C3-/-组小鼠银屑病皮损表型明显加重，如鳞屑及皮肤增厚(图1a～1b)。HE染色及半定量统计分析表明，C3基因缺陷显著增强IMQ刺激后银屑病典型病理改变，如角质形成细胞异常增殖、微脓肿及角化不全等(图1c～1d)。与上述结果相似，IHC染色发现C3-/-组角质形成细胞增殖(Ki67阳性细胞，图1e)较C3+/+组明显增多。上述结果表明：补体C3缺陷显著加重IMQ诱导银屑病皮炎病理过程。

2.2C3抑制IMQ诱导银屑病皮损局部炎症细胞浸润 与C3+/+组相比，C3-/-组银屑病皮损局部的CD3/4+T细胞、Ly-6G+中性粒细胞及F4/80+巨噬细胞(图2a)浸润均显著增多；
运用FCM方法检测到C3-/-组银屑病皮损组织CD45+白细胞以及Gr-1+CD45+中性粒细胞的百分率均显著增多，差异有统计学意义(图2b)。上述研究结果提示：补体C3抑制IMQ诱导银屑病皮炎局部炎症细胞浸润。

Note:*P<0.05， **P<0.01.Representative IHC staining for inflammatory cells(CD3/4, Ly-6G and F4/80) and semi-quantification graphs were presented (×200);Representative flow plots and graphs of infiltrated CD45+ leukocytes and Gr-1+CD45+ neutrophils were presented图2 C3基因缺陷显著增加IMQ诱导皮肤炎症细胞浸润Fig.2 C3-deficiency remarkably increased IMQ-induced inflammatory cells infiltration

2.3C3基因敲除促进IMQ诱导皮肤细胞凋亡 与C3+/+组相比，C3-/-组凋亡蛋白Cleaved casp3、Cyt C及BAK表达显著上调(图3a)；
C3-/-组TUNEL阳性凋亡细胞较C3+/+组增多，差异有统计学意义(图3b)。上述研究结果表明：补体C3缺陷促进IMQ诱导皮肤细胞凋亡。

2.4C3基因缺陷增强IMQ诱导IFN-γ应答 IMQ刺激可诱导T细胞分泌大量IFN-γ，且其主要来源细胞为CD8+CD3+T细胞(图4a)；
与C3+/+组相比，C3-/-组淋巴结细胞中IFN-γ+CD3+T及IFN-γ+CD8+T细胞频率显著增加，而两组IFN-γ+CD4+T细胞比例无明显差异(图4b～4d)。上述研究结果提示：补体C3缺陷促进IMQ诱导IFN-γ应答。

Note:**P<0.01, ns indicated no significance. Representative flow plots showed that CD4-CD3+CD8+T cells were the main source of IFN-γ;～Representative flow plots and graphs of IFN-γ+ T cell responses图4 C3基因缺陷明显上调IFN-γ应答Fig.4 C3 loss enhanced IFN-γ responses

2.5Z-VAD-FMK抑制凋亡显著缓解IMQ诱导C3缺陷小鼠银屑病皮炎反应 为明确银屑病皮炎是否依赖于IMQ诱导细胞凋亡，在C3-/-小鼠(C57B6/L背景)体内给予凋亡抑制剂Z-VAD-FMK并建立银屑病模型，结果发现：与对照组相比，Z-VAD-FMK组小鼠银屑病皮损明显衰减，如鳞屑及红斑(图5a～5b)。HE染色表明Z-VAD-FMK减轻银屑病典型病理改变，如角质形成细胞异常增殖、微脓肿及角化不全等(图5c)。同时，IHC染色发现阻断凋亡后角质形成细胞增殖(Ki67，图5c)明显减少。Z-VAD-FMK组皮损局部CD3+T细胞浸润明显减少(图5d)。此外，Z-VAD-FMK组TUNEL阳性凋亡细胞较对照组减少(图5e)。上述结果表明：Z-VAD-FMK抑制凋亡显著缓解IMQ诱导C3缺陷小鼠银屑病皮炎反应。

Note:*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.Psoriatic skin lesion phenotype(2 representative mice for each group);The mPASI scores for each group;Light microscopy examination of skin sections stained with HE(top, ×200) and IHC staining for Ki67(bottom, ×400);Representative images and graphs of IHC staining for CD3;Skin sections were subjected to TUNEL(red) and stained with the nuclear dye Hoechst 33258(blue) (×400)图5 抑制凋亡显著缓解IMQ诱导C3小鼠银屑病样皮炎反应Fig.5 Apoptosis inhibition attenuated IMQ induced psoriatic skin lesion in C3 deficient mice

2.6Z-VAD-FMK抑制凋亡明显衰减IMQ诱导IFN-γ应答 与对照组相比，Z-VAD-FMK组淋巴结细胞中IFN-γ+CD3+T细胞及IFN-γ+CD8+T细胞频率显著减低，而两组IFN-γ+CD4+T比例无明显差异(图6)。上述研究结果提示：Z-VAD-FMK抑制凋亡明显衰减IMQ诱导IFN-γ应答。

Note:*P<0.05， ns indicated no significant.图6a～6b 抑制凋亡显著减弱IMQ诱导IFN-γ反应Fig.6a～6b Apoptosis blocking attenuated IMQ induced IFN-γ expression

银屑病病理过程中补体系统激活已早有报道，然而补体C3在该过程中的作用及机制尚不完全明确[12]。本研究利用IMQ诱导银屑病样皮炎模型，发现补体C3缺陷明显加重IMQ诱导银屑病样皮炎，表现为：角质形成细胞增生、微脓肿、棘皮症及炎症细胞浸润等显著增加，角质形成细胞异常增殖(Ki67)，T细胞及中性粒细胞等炎症细胞浸润明显增加，凋亡相关蛋白(Cleaved casp3、Cyt C及BAK)表达显著上调，TUNEL阳性凋亡细胞明显增加。此外，FCM检测发现C3-/-小鼠皮损局部白细胞(CD45)及中性粒细胞(Gr-1)浸润较C3+/+组显著增加；
C3-/-小鼠腋窝引流淋巴结IFN-γ应答明显增强。与之相反，Z-VAD-FMK阻断凋亡途径后C3-/-小鼠皮炎明显减轻，角质形成细胞增殖减弱，TUNEL阳性细胞减少，CD3+T细胞浸润减少，IFN-γ应答明显减弱。上述结果表明：补体C3可能通过调节细胞凋亡,抑制IMQ诱导银屑病样皮肤炎症反应。

补体C3是补体系统枢纽分子，在调节天然免疫及适应性免疫应答中发挥重要作用，参与调节多种疾病进展，如病毒及寄生虫感染，移植排斥反应及自身免疫病等[13]。角质形成细胞组成性表达C3分子，皮炎过程中C3表达显著上调，表明C3在调节皮肤免疫稳态中发挥重要作用[14]。研究[15-16]发现，补体C3缺陷加速接触性皮炎程度，且上调炎症因子IL-12及IFN-γ表达，表明C3抑制接触性皮炎；
补体C3促进流感病毒A及其他细胞内病原体清除，缓解疾病进展。本研究结果发现，补体C3缺陷显著增强IMQ诱导银屑病皮炎，且伴随角质形成细胞异常增生，炎症细胞浸润增加，细胞凋亡增多及IFN-γ表达上调。与之相反的是，有研究[5]发现，利用小干扰RNA下调C3可显著缓解角质形成细胞Jun基因敲除导致银屑病皮炎程度。此外，IMQ可上调BALB/c小鼠耳部皮肤C3表达，而C3缺陷缓解IMQ诱导银屑病病情[17]。上述研究结果差异可能与银屑病模型、IMQ用量、组织特异性及小鼠背景差异等因素有关，其具体原因尚有待进一步研究明确。

IMQ促进细胞凋亡介导银屑病皮肤炎症反应，而补体C3调节凋亡细胞清除[8, 11]。本研究中，笔者发现C3基因敲除后IMQ诱导皮肤细胞凋亡及炎症反应显著增强。据此推测，凋亡细胞清除障碍导致炎症反应增强可能是C3敲除后银屑病皮炎加重的重要原因。为验证该推测，本研究利用凋亡抑制剂阻断IMQ诱导细胞凋亡后，C3敲除小鼠银屑病病情明显减轻，角质形成细胞增殖减弱，TUNEL阳性细胞减少，T细胞浸润及IFN-γ应答明显减弱。因此，笔者认为C3缺乏致凋亡细胞清除障碍及炎症反应激活是介导IMQ诱导银屑病病理过程的重要原因。

综上所述，本研究利用IMQ诱导银屑病皮炎模型发现：补体C3缺陷后银屑病皮损明显加重，角质形成细胞增殖加强，炎症细胞浸润、细胞凋亡及IFN-γ应答明显增强；
与之相反，阻断凋亡途径后C3敲除小鼠上述指标明显减弱，表明补体C3可能通过调节细胞凋亡抑制IMQ诱导银屑病样皮肤炎症反应。本研究揭示了补体C3在调节IMQ诱导银屑病皮炎病理过程中的重要作用，增加了对补体系统在银屑病发病机制中的认识，可为银屑病治疗提供新的策略。

本研究尚存在以下不足之处：①银屑病是一种极易复发的慢性炎症性疾病，本研究中探讨了补体C3在IMQ诱导银屑病样皮炎急性期的重要作用及可能机制，而C3在银屑病慢性化病理生理过程中的重要作用及机制尚不清楚，值得进一步探讨；
②角质形成细胞是皮肤组织补体C3的重要来源，特异性敲除角质形成细胞补体C3后IMQ诱导银屑病样皮肤炎症反应情况有待后期实验探讨。

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