中性粒细胞绝对值偏高【内毒素急性肺损伤与中性粒细胞凋亡研究现状】

　　[摘要] 内毒素（endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）成分，细菌死后细胞壁崩解时释出。内毒素可诱导肺泡巨噬细胞和上皮细胞产生多种细胞因子、趋化因子和激活中性粒细胞（polymorphonucler neutrophil，PMN）并使其向损伤部位聚集，导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。现有资料表明PMN凋亡延迟在急性肺损伤的发生过程中起到重要作用，了解PMN凋亡调控有利于调节机体炎症反应，可为ALI开辟新的治疗路径。
　　[关键词] 内毒素；急性肺损伤；中性粒细胞；细胞凋亡
　　[中图分类号] R563.02 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2012）02（a）-0011-03
　　
　　The research progress of polymorphonucler neutrophilic apoptosis of endotoxin-induced acute lung injury
　　ZHU Shanshan (review) LIU Gongjian (proofreader)
　　School of Anesthetic Academy, Xuzhou Medical Colloge, Jiangsu Province, Xuzhou 221000, China
　　[Abstract] Endotoxin releases from the death of the bacteria when the cell wall collapsed, which is (LPS) the component of the cell wall of gram-negative bacteria. LPS can induce alveolar macrophages and epithelial cells to produce multiple cytokines, chemokines and activate polymorphonucler neutrophils (PMN), and make them gather to the injury site, leading to acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Available informations have indicated that delayed apoptosis of PMN played an important role in ALI. Understanding of apoptosis regulation will be conducive to regulate PMN inflammatory response, expecting to find a new way for the treatment of ALI.
　　[Key word] Lipopolysaccharide (LPS); Acute lung injury (ALI); Polymorphonucler neutrophil (PMN); Apoptosis
　　
　　细胞凋亡（apoptosis）又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，不伤及邻近细胞，保持组织结构稳定，并将炎症反应限制在最小范围的高级调节过程。国内外研究发现，一些细胞因子、蛋白酶类及黏附分子等能通过抑制炎症细胞凋亡，延长炎症反应时间，而参与急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的炎症反应过程[1-2]。笔者复习近几年国内外相关文献，从PMN凋亡的角度对LPS急性肺损伤的发病机制作一综述。
　　1 中性粒细胞（PMN）凋亡与内毒素性ALI
　　PMN半衰期短，在外周血循环中存活8～20 h，而进入感染或发炎的组织内其存活时间可增加数倍。肺是PMN最容易聚集的器官，而肺组织中的PMN聚集发生于肺毛细血管床，此处PMN的含量是其他血管床的50倍[3]。若无细胞因子炎症因子参与，老化的 PMN会自发凋亡。与坏死不同，凋亡的PMN无细胞毒素释放到组织细胞周围。急性炎症时，PMN由于局部炎症介质的作用而发生凋亡延迟，凋亡延迟的PMN在炎症部位通过呼吸爆发产生大量自由基、蛋白水解酶及炎症介质等有害物质造成组织损伤，增加肺组织的炎症反应，从而导致ALI，降低存活率[4]。
　　2 PMN凋亡信号传导途径
　　2.1 核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）途径
　　NF-κB可通过介导多种炎症介质转录、表达和调控与凋亡相关的重要基因的表达来参与PMN凋亡的调控。内毒素刺激细胞后，核因子的抑制剂IκB（inhibitor κB，IκB）发生磷酸化降解，NF-κB与IκB发生解离，NF-κB迅速从细胞质移位到细胞核，在核内与目的基因，如编码诱导型一氧化氮合成酶（induced-nitric oxide synthase iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的κB位点特异性结合，来促进相关基因的转录，调控TNF-α细胞因子、黏附分子和炎症相关的酶及蛋白质的表达。反过来，NF-κB调节产物，如TNF-α、细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）又能激活NF-κB，形成一个能放大且延续炎症反应的复杂调节环路，导致全身炎症反应综合征（SIRS），诱发肺、肾及肝等多个脏器的损伤[5]。
　　NF-κB活化抑制PMN凋亡的机制可能为：①NF-κB活化促进促炎症细胞因子（IL-6、IL-8）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）表达，而抑制PMN凋亡；②NF-κB活化后可诱导细胞表达死亡受体-1（TNFR1）、结合因子（TFAF1、TFAF2）和凋亡抑制蛋白（IAP1、IAP2），抑制Caspase级联反应，阻断死亡受体TNFR1和Fas介导的凋亡信号传导，抑制细胞凋亡；③NF-κB活化亦可能通过调控A1等Bcl-2家族抗凋亡蛋白的表达来抑制PMN凋亡[6]。通过以上叙述不难看出NF-κB的转移及活化是SIRS或ALI的关键环节之一。抑制NF-κB信号通路，可有效地抑制ALI中TNF-�炎性因子的产生。若在ALI早期抑制NF-κB活化，可为防治ALI/ARDS提供新的靶点。
　　2.2 Fas-Fasl途径
　　Fas属于细胞表面受体家族，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子质量为45 000，在白细胞、肺泡巨噬细胞及肺组织等多种细胞组织均有表达。Fasl为Fas的配体，是一种相对分子质量为40 000的Ⅱ型膜蛋白，主要在活化的淋巴细胞和自然杀伤细胞中表达。Fas-Fasl结合后引起Fas抗原三聚体化，Fas胞内区的死亡结构域（DD）与胞质中已有的Fas相关死亡结构域（fas associated death domian，FADD）C端的DD结合，FADD再以N端的DED（death effector domian）与Procaspase-8（或Procaspase-10）N端前区域内的DED结合形成死亡诱导信号复合体（death inducing signal complex，DISC），Procaspase-8发生裂解后活化，并使Caspases家族的一系列凋亡蛋白酶的激活，从而引发Fas蛋白所在的细胞凋亡。Caspase-8激活下游的Caspases 诱导的凋亡主要有两种信号通路[7-8]，第一条信号途径是在当DISC中Caspase-8充足时，通过激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，引起细胞裂解而凋亡。而当caspase-8不足时，通过第二条信号途径，即Caspase-8催化断裂Bcl-2家族的促凋亡成员bid形成的裂解片段p15移入线粒体，破坏线粒体膜的完整性，使细胞色素C释放，细胞色素C再与胞质中凋亡蛋白酶活化因子-1结合，来激活Procaspase-9。Caspase-9被活化，随之激活Caspase-3等酶系导致细胞凋亡。Nwakoby等[9-10]观察到PMN对Fas诱导的凋亡较敏感，在表达高水平Fas的同时也显著表达Fasl，在感染血清中Fasl的浓度与PMN凋亡率呈正相关，抗Fasl抗体能对抗感染血清诱导的PMN凋亡，活化型Fas抗体IgM可以显著加速PMN的自发性凋亡进程，而拮抗型Fas抗体IgG1则有凋亡抑制功能。激活的Caspase-3通过蛋白水解来激活DNA酶，介导细胞染色体DNA碎裂和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）移向膜外，启动细胞凋亡，因此，细胞中激活的Caspase-3减少就意味者细胞凋亡的延迟。SIRS过程中过量释放的炎症因子如TNF-α、γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-8（IL-8）、脂多糖（LPS）等被证明可通过调控Fas等凋亡基因的表达抑制PMN的凋亡[11]。Fasl和TNFR1的表达下调，Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8的表达下调，游离出肺上皮内皮屏障的PMN中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活化受到抑制[12]，这些都导致PMN的寿命延长， 造成肺组织中PMN超负荷而释放大量的炎性代谢产物，加重肺损伤。
　　3 PMN凋亡的调节
　　3.1 细胞因子
　　一般情况下，PMN在病原体消除后很快就会被机体清除，但是某些炎性因子如LPS、TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β、GM-CSF可抑制PMN的凋亡[13]。赵志勇等[14]对30例体外循环（CPB）心脏直视手术病例在不同的时间点抽取静脉血，测定PMN数量、PMN凋亡率、血浆白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）浓度，发现PMN凋亡率在CPB期间明显降低，与CPB时间呈负相关。PMN数量、IL-6、IL-8血浆浓度在CPB期间明显升高，与其凋亡率呈负相关，与CPB时间呈正相关，认为CPB期间细胞因子IL-6、IL-8释放增多导致PMN的凋亡延迟、PMN数量增加、生存周期延长，从而加剧炎症反应扩散和组织损伤。TNF-α被认为是引起ALI/ARDS的最重要的细胞因子之一，LPS刺激单核巨噬细胞后可释放大量的TNF-α，能直接损伤肺血管内皮细胞，并能动员、趋化、黏附、聚集、激活PMN，使肺内的PMN急剧增多，而且可增强 PMN的吞噬能力，促进PMN脱颗粒和释放溶酶体酶，增强PMN呼吸爆发，产生过多的氧自由基，它还可激活NF-κB介导其他细胞因子（如IL-1、IL-6、IL-8）的合成与释放，启动炎症级联反应[15]。
　　3.2 蛋白酶类
　　PMN中含有多种蛋白酶，其中弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）与肺组织损伤关系最为密切，有实验已经证实，在LPS诱导大鼠急性肺损伤动物模型肺内，NE的表达量与活性明显增加[16]。炎症状态下，激活的PMN可释放NE，NE可消化肺组织结构中的弹性蛋白，分解细胞间的纤维连接蛋白，造成弹性纤维和胶原纤维断裂、分离，损伤血管内皮细胞和基底膜组织细胞，使富含蛋白质的液体进入到肺泡腔、肺间质导致肺水肿、肺不张；NE能损伤肺泡上皮细胞，破坏肺泡表面活性物质，使肺泡扩张[17]，还可裂解巨噬细胞表面的磷脂酰丝氨酸受体和CD14，特异性阻断巨噬细胞对凋亡细胞的识别，使气道内凋亡细胞清除不足，导致ALI的持续进展。另外金属蛋白酶（MMPS）也参与细胞外基质裂解，活化的PMN可释放大量的MMP-8及MMP-9，其中MMP-9的主要底物Ⅳ型胶原就是血管基底膜的主要成分。实验研究已经发现，抑制PMN弹性蛋白酶或基质金属蛋白酶的活性可以降低脓毒症所致动物ALI的发生率并改善呼吸功能[18-19]。曾在2003年作为非典治疗药物用于临床的特异性NE抑制剂――西维来司他（Sivelestat），近年来通过动物实验及临床研究发现，该药可提高脓毒血症大鼠的生存率，减轻脓毒血症鼠的全身炎症反应，可改善ALI患者的肺功能，能缩短患者ALI持续时间、ICU停留时间及住院时间，有望成为治疗ALI的亮点药物[20-22]。
　　3.3 黏附分子
　　细胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互结合的重要活性物质，它在维护正常组织的稳定、介导炎症细胞的迁移、血栓的形成以及肿瘤转移等过程中起重要的作用。国内曾涟等[23]采用盲肠结扎穿孔术复制脓毒症动物模型，以探讨脓毒症大鼠肺组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达变化及其与急性肺损伤的关系，结果发现，脓毒症4 h后大鼠肺组织中ICAM-1的表达水平升高，并持续升高至24 h，同时伴有支气管肺泡灌洗液白细胞计数、肺湿/干重比的增加和肺组织病理损害的加重。免疫印迹法测定ICAM-1的表达与支气管肺泡灌洗液白细胞计数、肺湿/干重比呈正相关，认为脓毒症大鼠肺组织中ICAM-1呈过度表达，并参与了脓毒症肺损伤过程[24-25]。组织炎症时，在黏附分子与细胞膜受体的相互介导下，PMN被激活导致β2整合素表达上调而L-选择素下降，不仅使穿过内皮向炎症区迁移的PMN活力增强，而且使细胞死亡的程序表达延迟，可能是整合素与配体结合，启动酪氨酸激酶及丝氨酸-苏氨酸依赖性激酶，使细胞内钙离子释放所致。
　　4 小结与展望
　　综上所述，PMN作为机体内最活跃的炎症细胞，可被LPS诱导激活并向损伤部位聚集，而产生炎症因子的瀑布式反应，导致ALI等炎性疾病恶化，而PMN的凋亡延迟会进一步加重肺损伤，适度清除PMN，抑制PMN的凋亡延迟是控制炎症发展的重要举措。深入研究PMN与ALI的关系，可为进一步揭示ALI的发病机制提供理论基础，为设计研发具有针对靶器官治疗的药物带来新的突破。
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　　（收稿日期：2011-10-25 本文编辑：卫 轲）

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