苹果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选:实时荧光定量pcr内参基因

　　摘要： 【目的】为筛选苹果实时荧光定量PCR实验中最适内参基因，【方法】应用实时荧光定量PCR技术，分析5个传统内参基因18SrRNA、ACTB、GAPDH、UBQ、TUB在苹果不同基因型、不同组织、果实不同发育时期的mRNA表达差异情况。供试的6个不同基因型苹果分别为：新疆野生苹果、八棱海棠、丽江山荆子、‘津轻’、‘国庆’、‘金冠’；6种不同组织为果皮、果肉、叶片、愈伤组织、花瓣、种子；5个果实发育不同时期为花后28、50、74、95、115 d。【结果】经geNorm 程序分析发现5 种内参基因的表达稳定性各异，UBQ在果实不同基因型和不同发育时期的基因表达分析中最稳定； ACTB和UBQ在6种不同组织中表达均稳定。【结论】UBQ在参试样品中表达均比较稳定，是研究苹果基因表达分析中理想的内参基因。
　　关键词： 苹果； 实时荧光定量PCR； 内参基因； geNorm程序
　　中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2012？雪06-965-06
　　近年来，实时荧光定量PCR（Real Time Fluorescence Quantitative PCR， RT-qPCR）技术已被广泛应用于多个物种基因表达的绝对定量和相对定量研究中。与传统的RNA定量技术相比，RT-qPCR对于低拷贝数的mRNA具有更灵敏的探测能力[1]，在相对定量检测中，为了比较不同样本mRNA表达量水平，要求不同样本之间起始细胞数目相同，RNA提取效率相同，且目的基因的扩增效率相同，但这些条件不可能同时满足，导致基因表达差异比较大[2]。为了避免不同样本在RNA的产量、质量、逆转录效率以及扩增效率上可能存在的差别， 通常利用内参基因进行数据校正和标准化[3]。
　　理想化的内参基因应在各种类型的组织、细胞和各种实验因素条件下均能恒定表达。然而，大量的研究结果表明，并没有表达绝对稳定的基因，任何一种管家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下“有范围”的恒定[3]。随着对定量要求的不断提高， 为了得到更可靠的实验结果， 实验中需要选择较为合适的1个或多个内参基因进行校正。
　　GeNorm（http：//medgen.ugent.be/wjvdesomp/genorm/）是基于Excel程序开发出用于评价内参基因稳定性和变异系数的软件，该软件程序首先将某一内参基因与其他内参基因表达水平进行两两比较和对数转换，获得其平均标准差，而后将该平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M，再对所有候选内参基因的表达稳定性进行排序，同时根据标准化因子的配对差异分析结果判定所需内参基因的最适数目[4]。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.2 方法
　　1.2.4 数据处理和分析 将各组织的cDNA稀释液作为实时荧光定量PCR的反应模板，反应体系和条件同标准曲线反应体系。将得到的Ct值数据输入geNorm程序运行，该程序能够计算出每个候选基因表达稳定度的平均值M，根据M值的大小对内参基因的表达稳定度进行排序（M值越小，表达就越稳定），选出最优内参基因，同时通过内参基因的标准化因子的配对差异分析（Vn/n+1）能够判定内参基因的最适数目。
　　2 结果与分析
　　2.1 总RNA的提取
　　2.2 内参基因的PCR分析
　　2.3 内参基因的荧光定量PCR分析
　　以苹果不同材料来源的第1链cDNA为模板， 进行实时荧光定量PCR分析。分析结果从表1中列出的5个候选内参基因标准曲线斜率及PCR扩增效率可以看出，标准曲线斜率均大于0.98，显示出较好的线性关系；同时，这5个内参基因也表现出良好的扩增效率，说明定量结果准确、可靠，所用引物可特异性扩增DNA序列。从图3～5可以看出， 5个内参基因在苹果不同组织中的表达水平都有一定的变化；其中18SrRNA作为传统内参基因的表达丰度相对较高，其表达量是其他基因的几倍，GAPDH、UBQ、TUB的Ct值居中，而ACTB表达丰度则较低。
　　2.4 内参基因的表达稳定性分析
　　3 讨 论
　　Xu等[9]在对杨树实时定量PCR的9个内参基因的筛选中发现EF1a和18SrRNA表达最稳定。Yan等[10]在对柑橘RT-qPCR的7个内参基因的筛选中则发现18SrRNA， ACTB和rpII表达最稳定。Jain等[11]通过对水稻（Oryza sativa）中10个常用内参基因的检测， 发现UBQ5和eEF-1α在不同组织中的表达比较一致， 18SrRNA和25SrRNA在不同环境处理下表达较为稳定。Kim等[8]分析了 4个水稻内参基因 （18SrRNA、GAPDH、ACT、TUB ）表达稳定性，结果表明18SrRNA在不同发育时期以及不同品种和紫外伤害下的2组黄化苗中，表达均最为稳定。以上研究均发现18SrRNA作为内参基因表达最稳定，而本文结果表明18SrRNA虽然在苹果各个组织中表达丰度很高，但其稳定性较差，不适合做苹果不同组织基因表达的内参基因，这与Brunner等[12]的研究结果一致，即常被用来作内参基因的18SrRNA基因的稳定性并不十分理想。原因可能在于18SrRNA在荧光定量PCR中表达丰度偏高，而目标基因丰度较低导致定量结果准确性降低；其次，18SrRNA要求反转录必须使用随机引物，但目标基因反转录常使用 oligo dT，这可能会使2者的反转录效率不同而影响基因表达水平的可比性；再者，不同生理状态的组织器官中 rRNA与mRNA的比例并不是恒定不变的[13]，其转录易受到各种生物因素和药物的影响，导致其表达水平也并不恒定，例如在有丝分裂期间，18SrRNA明显减少或停止表达；最后，RNA的部分降解对18SrRNA的表达水平的影响可能要小于对mRNA的影响[14]。
　　目前，在龙眼[15]，桃[16]和葡萄[17]等果树中已经有了关于内参基因稳定性筛选的报道，他们分别筛选出 UBQ、Fe-SOD、TEF2、UBQ10、RP II还有GAPDH， actin，EF1-α等几个相对稳定的内参基因。结合本文研究结果可以看出，不同内参基因在果树中稳定性各不相同。本文研究的5个基因为研究较多的传统内参基因，均是生物体维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分或参与生物体的基本生化代谢过程，其在所有的细胞和生理状态下都能较稳定地表达；ACTB在维持细胞结构、细胞内运动、细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用；GAPDH是糖酵解和糖异生过程的关键酶，参与糖酵解过程中第1个ATP形成，表达量较高[18-19]；TUB是生物体维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分；UBQ则参与生物体的基本生化代谢过程，是细胞内一个重要的蛋白质降解调节系统，可以影响或调节多种细胞活动。本文对以上5个传统内参基因在苹果17份不同cDNA材料中的表达结果显示，在研究苹果不同基因型和苹果不同发育时期的基因表达时，应选择UBQ作为内参基因，而研究苹果不同部位、不同组织的基因表达时，内参基因应首选ACTB。当然在追踪基因表达的微小变化时，单独使用一个内参基因往往不能得到准确的定量结果，这时可以同时列出2个或几个内参基因进行内参校正。 　　在苹果后基因组时代，内参基因的获得将不再局限于几个传统基因，而更稳定表达更能广泛使用的新内参基因的获得除了从大量基因表达芯片数据和EST数据库中发现新的内参基因[20]，还可以像拟南芥（Arabidopsis thaliana）[21]等一些重要模式生物一样，通过利用全基因组搜索并经过实验验证来获取可靠的内参基因。
　　4 结 论
　　对苹果5个内参基因（18SrRNA、ACTB、GAPDH、 UBQ、TUB）进行荧光定量PCR稳定性分析，结果表明，UBQ在苹果不同基因型以及果实不同发育时期中表达均最稳定，ACTB虽然表达丰度偏低，但是在苹果不同组织的基因表达分析中表现最稳定。在苹果不同基因型和苹果不同组织的基因表达分析中，不同内参基因之间的稳定性表现出了较大的差异，而UBQ在前一组材料中表达稳定性最高，在后一组材料中也表现出了仅次于ACTB的稳定性，并可以取代其做为苹果不同组织的最适内参基因。
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