缺血性脑卒中患者血清miR-155和PDCD4,mRNA表达水平与颈动脉支架成形术后再狭窄的相关性研究

杜龙庭，勿坡巫且，许春梅，李 炜（.凉山彝族自治州第二人民医院神经内科，四川凉山 65000；
.陆军特色医学中心神经内科，重庆 40004）

缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）是由于脑的供血动脉狭窄等引起脑部供血不足，导致脑组织坏死的一类疾病，常会引起神经功能障碍、动脉粥样硬化等疾病[1-2]。研究发现约50%的CIS 患者存在颈动脉狭窄，随着现代医疗技术的发展，血管内介入治疗逐渐增多，颈动脉支架成形术（carotid artery stenting,CAS）因其具有较好的近期疗效、创伤小、康复迅速等优点被逐渐认可，但其中远期并发症主要表现为再狭窄，再狭窄对患者的生命健康会造成一定的威胁[3-4]，研究发现，机体内某些异常表达的细胞因子常会介导大量炎症因子释放，进而导致神经细胞的炎症反应及异常凋亡等，对CIS的发病及颈动脉狭窄具有不利影响[5]，因此研究相关细胞因子的变化情况对于预防CAS 术后再狭窄具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来发现的参与器官发育、细胞增殖、凋亡等多种生理活动的非编码单链RNA，微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）在心肌细胞、血管平滑肌细胞等细胞的凋亡、增殖、转移过程中均有表达，与机体缺血损害及氧化损害密切相关[6-7]。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）在CIS 后呈现高表达，具有调控细胞凋亡及炎性反应、加重CIS 病情的作用[8]。本文通过对CIS 患者血清中miR-155，PDCD4 信使RNA（messenger RNA，mRNA）表达情况进行分析和测定，探讨其与CAS 术后再狭窄的关系，为预防CAS 术后再狭窄提供理论依据。

1.1 研究对象 选择2016年2月～2020年7月在凉山彝族自治州第二人民医院确诊的CIS 患者120例作为CIS 组，其中男性69 例，女性51 例，年龄42～75 岁，平均年龄60.47±11.63 岁，平均体质量指数（body mass index，BMI）为22.69±1.82 kg/m2。同期选取医院健康体检者125 例为对照组，男性65 例，女性60 例，年龄46～76 岁，平均年龄62.09±12.11 岁；
平均BMI 为22.57±1.76 kg/m2。两组研究对象年龄、性别和BMI 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经凉山彝族自治州第二人民医院伦理委员会批准，且受试者均签署知情同意书。

纳入标准：①CIS的诊断标准参考《脑梗死和脑出血中西医结合诊断标准》[9]；
②均出现颈动脉狭窄且接受CAS 治疗；
③脑功能损伤症状及相应体征持续超过1 h；
④血管狭窄程度大于70%，临床资料完整。排除标准：①伴有严重肝肾功能障碍、心律失常、恶性肿瘤等；
②伴有黏膜出血等疾病患者；
③脑部CT 检查出现颅内出血；
④近期有重大手术患者、脑外损伤等。

1.2 仪器与试剂 RNA 提取试剂盒（购自美国Invitrogen 公司，批号603017）；
反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）（ 购自日本TAKARA 公司，批号RA0153）；
荧光定量PCR 试剂盒（miScript SYBR®Green Mix）（购自德国QIAGEN 公司，批号S21054）；
实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪（购自美国Bio-Rad 公司，型号CFX384）；
彩色多普勒超声诊断仪（购自德国西门子公司，型号ACUSON X150）；
全自动血流变分析仪（购自深圳市华科瑞科技有限公司，型号HT-100B）。

1.3 方法

1.3.1 血液样品预处理：采集CIS 组患者术前、术后24 h，健康体检者体检时空腹肘静脉血3～5 ml，室温静置20min，4℃下3 000 r/min 离心10 min，收集血清装至特定离心管中，于-80℃冰箱保存备用，用于后续RNA的提取及相关指标的测定。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清miR-155，PDCD4 mRNA的表达水平：利用RNA 提取试剂盒提取血清总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录得到cDNA。采用qRT-PCR 法对miR-155，PDCD4 进行扩增。qRT-PCR 反应体系共20μl：miScript SYBR®Green Mix 10 μl，cDNA（50ng/μl）2μl，正、反向引物（10μM）各1μl，ddH2O 6μl。反应条件：95℃ 90s ，95℃ 30s ，62℃30s ，72℃ 15s ，共40 个循环。miR-155 以U6 作为内参，PDCD4以GAPDH作为内参，引物序列见表1。引物由广州健仑生物科技有限公司合成。采用2-ΔΔCt法对血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 患者术后180 天超声指标和血液流变学指标测定：术后180 天，对CIS 患者进行脑多普勒超声检查、颈动脉彩色多普勒超声检查，观察患者颈动脉狭窄程度、不稳定斑块数量、斑块长度及斑块厚度；
再狭窄判定标准：术后支架内管径狭窄程度大于50%[10]，根据再狭窄评定标准分为未狭窄组94例与再狭窄组26 例。采用全自动血流变分析仪测定患者血浆黏度、全血黏度、红细胞比容、纤维蛋白原水平。

1.4 统计学分析 利用SPSS 25.0进行统计学分析。以均数±标准差（±s）对计量资料进行描述，两组间比较采用独立样本t检验，三组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验 ；
计数资料用n进行描述，行χ2检验；
受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平对CIS 患者行CAS 术后再狭窄的诊断价值。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.1 对照组与CIS 组血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平比较 见表2。与对照组相比，CIS 组术前血清miR-155表达水平显著降低（q=45.189，P=0.000），CIS 组术前和术后24 h 血清PDCD4 mRNA表达水平均显著升高（q=40.422，P=0.000和q=5.390，P=0.000），差异均有统计学意义；
与CIS 组术前相比，CIS 组术后24 h 血清miR-155表达水平显著升高（q=42.179，P=0.000），血清PDCD4 mRNA表达水平显著降低（q=34.680，P=0.000），差异均有统计学意义。

表2 对照组与CIS 组血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平比较（±s）

表2 对照组与CIS 组血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平比较（±s）

项目对照组（n=125）CIS 组术前（n=120）CIS 组术后24 h（n=120） F 值P 值miR-1551.01±0.20 0.31±0.06 0.97±0.21 636.240 0.000 PDCD4 mRNA 1.03±0.20 2.23±0.45 1.19±0.29 476.769 0.000

2.2 术后未狭窄组与再狭窄组术后24 h 血清miR-155，PDCD4mRNA表达水平及相关临床指标比较 见表3。与未狭窄组相比，再狭窄组颈动脉狭窄程度、术后24 h 血清PDCD4 mRNA表达水平、不稳定斑块数量、斑块长度、斑块厚度、血浆黏度、全血黏度、红细胞比容、纤维蛋白原显著升高，术后24 h 血清miR-155表达水平显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 术后未狭窄组与再狭窄组术后24 h 血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平及相关临床指标比较（±s）

表3 术后未狭窄组与再狭窄组术后24 h 血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平及相关临床指标比较（±s）

项目未狭窄组（n=94）再狭窄组（n=26）t 值P 值颈动脉狭窄程度（%）9.11±2.5221.31±5.3316.5830.000 miR-1551.03±0.250.36±0.099.0740.000 PDCD4 mRNA1.06±0.262.18±0.5414.9010.000不稳定斑块数量（个）2.87±0.715.51±1.2713.8590.000斑块长度（mm）3.16±0.797.60±1.9017.8740.000斑块厚度（mm）2.84±0.714.60±1.159.6500.000血浆粘度（mPa·s）11.01±2.7515.03±3.856.0680.000全血粘度（mPa·s）3.71±0.925.84±1.469.0880.000红细胞比容（%）46.51±11.6258.98±17.744.2770.000纤维蛋白原（g/L）3.01±0.754.93±1.239.9140.000

2.3 术后24 h 血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平对CIS 患者行CAS 术后再狭窄的诊断价值 见图1。ROC 曲线结果表明，术后24 h 血清miR-155表达水平诊断CAS 术后再狭窄曲线下面积（AUC）为0.778（95% CI 为0.692～0.864），敏感度为80.7%，特异度为74.5%，截断值为0.72；
术后24 h 血清PDCD4 mRNA表达水平诊断CAS 术后再狭窄的AUC 为0.838（95% CI 为0.749～0.926），敏感度为80.8%，特异度为78.7%，截断值为1.54。

图1 术后24 h 血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平对CIS 患者行CAS 术后再狭窄诊断的ROC 曲线

缺血性脑卒中（CIS）是高致残率、高致死率、高复发率的神经系统疾病，颈动脉狭窄是该疾病的主要病因，常会加剧各种心脑血管并发症的发生，严重影响患者的生活质量及心理健康[11-12]。随着医疗技术及影像学技术的不断改良与发展，血管内CAS 治疗CIS 颈动脉狭窄取得较大进步，具有无需全麻、无需颈部切口、术后恢复快、住院时间短等优点，但资料显示CAS 长期效果并不理想，易产生术后再狭窄[13-14]。研究发现术后再狭窄与动脉周围炎性因子、炎性血管病、斑块破裂、斑块糜烂、神经元凋亡等相关，术后再狭窄易引起脑卒中复发等，对患者的生命健康造成威胁，因此研究与术后再狭窄相关的因子的变化具有重要意义[15]。

miR-155 是位于人类21 号染色体上B 细胞非编码基因整合集群的第三个外显子内，是参与免疫调节以及血管炎症反应的关键因子，miR-155的靶基因主要是与凋亡相关的基因，miR-155 低表达与心肌细胞、血管内皮细胞凋亡、缺血反应等过程密切联系[16]。PDCD4 是一种典型的促炎蛋白，其在急性冠状动脉综合症事件的发生发展等多个阶段扮演着重要的角色，有研究认为PDCD4 不仅能够抑制多种心血管细胞的增殖，且与动脉粥样硬化斑块的形成也密切相关[17]。还有研究发现PDCD4 具有抑制抗炎因子翻译及促进炎性因子分泌等作用，是miR-155 调控细胞凋亡的重要靶基因，miR-155 低表达会激活PDCD4，引发血管内炎性反应及内皮细胞凋亡等，进而增加血管狭窄程度，对于冠状动脉狭窄具有潜在的诊断价值[18-19]。另有研究认为当血管内不稳定斑块数量较多、血液黏度变大、血液流动性变差时，易引发血管栓塞、狭窄等病变[20]。本研究结果显示，与对照组相比，CIS 组患者血清miR-155表达水平显著降低，CIS 组患者术前和术后24 h 血清PDCD4 mRNA表达水平显著升高；
且与术前相比，CIS 患者术后24 h 血清miR-155表达水平显著升高，PDCD4 mRNA表达水平显著降低，与相关研究[21]结果一致，提示血清miR-155，PDCD4 mRNA水平与CIS的发生以及治疗效果可能有一定关系，具体原因尚不明确，猜测CAS 治疗效果可能得益于miR-155 调控PDCD4 减轻炎症反应以及抑制内皮细胞凋亡，减少颈内动脉不稳定斑块的形成、数量，因此认为其有望成为减缓动脉粥样硬化或抑制斑块形成的靶点。

本研究结果还显示，120 例患者中产生术后再狭窄26 例，与未狭窄组相比，再狭窄组颈动脉狭窄程度、术后24 h 血清PDCD4 mRNA表达水平、不稳定斑块数量、斑块长度、斑块厚度、血浆黏度、全血黏度、红细胞比容、纤维蛋白原显著升高，术后24 h 血清miR-155表达水平显著降低，表明不稳定斑块的形成、血液流变指标异常与术后颈动脉再狭窄联系密切，miR-155 低表达及PDCD4 mRNA高表达均不利于术后血管的修复，对于CIS 病情的缓解具有不利影响。ROC 曲线分析结果表明，术后24 h 血清miR-155，PDCD4 mRNA 诊断CAS 术后颈动脉再狭窄的敏感度及特异度较高，当CIS 患者术后24 h 血清miR-155表达水平小于0.72，血清PDCD4 mRNA表达水平大于1.54 时，患者发生CAS 术后颈动脉再狭窄的可能性较大，需尽早采取措施预防再狭窄的发生，此结果与陆振涛等[19]研究结果基本一致，进一步说明血清miR-155，PDCD4 mRNA的表达量与冠状动脉病变指数、冠状动脉狭窄程度及预后密切相关，推测二者可作为早期评估CIS 病情及CAS 术后再狭窄的重要指标。

综上所述，血清miR-155，PDCD4 mRNA表达水平的变化与CIS 病情和CAS 术后再狭窄密切相关，二者对于CAS 术后再狭窄的发生具有一定的诊断价值。然而关于miR-155和PDCD4 mRNA 在CAS 术后再狭窄中异常表达的机制尚不清晰，仍需进一步研究。

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