基于网络药理和分子对接探究黄芪葛根汤治疗糖尿病的作用机制*

闫浩 刘潇潇 于春雪 孙轲强 成帆 王虎 宋逍*

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，会导致各种组织，特别是肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。西医在防治糖尿病方面取得了较好的疗效，但作用靶点单一，长期治疗会出现价格昂贵、耐药和不良反应等问题，因此，探寻治疗糖尿病有效药物仍迫在眉睫[1]。

黄芪葛根汤，中医方剂名，出自《证治汇补》，益气健脾，滋阴清热，生津止渴[2]。研究发现黄芪葛根汤可明显改善老年糖尿病患者的临床症状和胰岛素抵抗情况[3]；
还能显著提高糖尿病大鼠胰岛素的敏感性，改善糖代谢[4]。但由于中药成分的复杂性和药理作用的多重性使得难以对中药复方作用机制展开全面、系统的研究。

网络药理学是将生物学网络与药物作用网络整合，从多成分、多靶点、多途径的角度阐明中药研究的基础理论，与中医药的整体辨证论治观念不谋而合，为中药现代化研究提供全新的思路[5-6]。分子对接是研究蛋白与配体结合模式的强有力的工具[7]。本研究通过网络药理和分子对接研究黄芪葛根汤治疗糖尿病的蛋白相互作用关系、生物过程和代谢通路等机制，为中药复方治疗疾病在网络药理学方面的科学研究提供参考。

1.1黄芪葛根汤中活性成分的筛选和靶点的收集 首先，在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[8]中搜索黄芪葛根汤中黄芪和葛根的相关参数。然后查阅文献[9-10]并结合实际以(类药性DL≥0.18)为筛选标准，筛选出黄芪和葛根的活性成分。其次，通过TCMSP平台中的Targets Infomation查找黄芪和葛根相关靶点，最后通过Uniprot数据库转化为基因格式。

1.2黄芪葛根汤活性成分治疗糖尿病作用靶点的搜索与获取 通过在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、人类基因卡片数据库(GeneCards)，以“diabetes mellitus”为关键词检索与糖尿病有关的基因，与上步所得黄芪葛根汤有效成分靶点韦恩映射，得到交集基因，即为黄芪葛根汤活性成分治疗糖尿病的预测靶标基因。

1.3网络可视化构建及分析 将黄芪葛根汤、筛选所得有效成分、疾病的交集基因、疾病导入Cytoscape，构建药物-有效成分-交集靶点-疾病相互作用网络图，使其关系可视化。

1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)的构建 将上步映射基因导入STRING数据库，获取蛋白互作关系数据，保存为TSV文件，利用R语言绘制核心靶点图。

1.5药物候选成分与核心靶点的分子对接 首先将Cytoscape网络中的候选成分通过Pubchem数据库查找2D/3D结构，保存成SDF格式，用ChemBio3D软件打开，使用MM2进行力场构象优化，保存成Mol2格式，利用AutoDock Tools保存为PDBQT格式备用。其次选择PPI中相互作用最紧密的3个靶标，在RCSPDB数据库中查找靶点，对蛋白进行除水，除配体，加氢操作。利用AutoDock Tools建立蛋白中心格点，设置盒子大小，利用Scripps研究所Olson课题组开发的Autodock vina软件[11]将药物有效成分与3个核心靶点进行分子对接，选择能量最低的结合模式做图。

1.6基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析 利用Bioconductor数据库对交集基因进行GO和KEGG功能富集分析，得到黄芪葛根汤在治疗糖尿病中的主要功能富集和作用通路。

2.1黄芪葛根汤活性成分的筛选 通过 TCMSP 数据库筛选黄芪葛根汤中黄芪和葛根DL≥0.18的活性化合物，收集到黄芪的有效成分47个，葛根有效成分16个，其中有4个共同成分daidzein(大豆苷元)，Ononin(芒柄花苷)，formononetin(芒柄花素)，LUPENONE(羽扇烯酮)，最终共获得59个活性成分，见表1。

表1 黄芪葛根汤中的活性成分

2.2黄芪葛根汤治疗糖尿病的靶标预测 通过TCMSP数据库Targets Infomation功能筛选黄芪和葛根有效成分对应的靶标，去除重复性得到152个靶点，将所有靶点经过Uniprot数据库查询转化成基因符号格式。通过Genecards和OMIM数据库筛选糖尿病的相关靶点蛋白，去除重复项，得到10095个糖尿病相关的靶点。将有效成分对应靶标与糖尿病靶标韦恩映射，获得135个共同基因，即黄芪葛根汤治疗糖尿病的预测靶标，见图1。

图1 药物有效成分靶点与疾病靶点的韦恩图

2.3网络药理的可视化 通过Cytoscape软件将黄芪葛根汤、有效成分、交集基因、疾病相连，绘制黄芪葛根汤-活性成分-靶点-疾病相互作用网络图，如图2，图中蓝色方形节点代表黄芪葛根汤，红色六边形节点代表疾病，粉色方形节点代表候选活性成分，蓝色圆形节点代表交集靶点，图中网络图显示黄芪葛根汤的一种有效成分可作用于多个靶点，同一靶点可由不同的有效成分作用，体现了中药复方的复杂性和整体性，也反映了黄芪葛根汤多成分-多靶点作用的特点。

图2 药物-成分-靶点-疾病网络图

2.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析 将上步所得核心基因利用STRING数据库进行分析，设置相互作用分值为0.7，同时隐藏离散的点，下载对应TSV文件运用R语言对节点的拓扑参数进行分析，得到核心靶点图(见图3)，由图可知，EGFR，IL6，MYC为核心靶标，与黄芪葛根汤治疗糖尿病相关性最大。

图3 PPI中的核心基因

2.5分子对接分析 利用Autodock Vina 软件将Cytoscape网络中的候选活性成分与PPI中degree值较大的3个靶点蛋白(EGFR、IL6、MYC)进行分子对接，结果常春藤皂苷元与EFGR、IL6靶点的亲和能最低(-8.9 kcal·mol-1，-7.6 kcal·mol-1)，羽扇豆醇与MYC的结合能最低(-7.5 kcal·mol-1)，选取最优结合构象做出化合物与蛋白结合图，如图4所示。图a为常春藤皂苷元与EFGR分子对接图，常春藤皂苷元占据了由残基VAL284，CYS283，SER282，GLY264，PHE230，LYS229，ARG228，LEU120，ARG84和ASN86形成的活性空腔，其羧基与GY264，SER282，CYS283形成3个氢键，9号羟甲基中的羟基与PHE230形成1个氢键。在候选化合物中，常春藤皂苷元与IL6靶点的亲和力依然显示出最低结合能，图b显示常春藤皂苷元与IL6的亲和模式，其10位上的羟基与ARG182形成2个氢键，其结构与ARG30，LEU33，SER37，GLN175，ARG179氨基酸残基存在疏水作用。图c中，MYC的活性空腔由ARG17，LEU15，ARG19，GLU22，LYS50，VAL46，PRO44，GLN18构成，羽扇豆醇能够很好地占据MYC的活性空腔，其上的羟基与ARG19上的氨基形成氢键，且与VAL46，LEU15，LYS50存在较好的疏水作用。

2.6GO富集分析 利用Bioconductor对PPI中的映射靶点进行GO功能富集分析，取排名前20的基因富集绘制条形图(见图5)，横坐标表示靶点数，纵列表示功能富集分类，颜色表示p.adjust值，p.adjust值越小颜色越偏向红色，反之，越偏向蓝色。由图可知，功能富集分析基因数量较大的有DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific,peptide binding,ubiquitin-like protein ligase binding,amide binding等，说明靶点涉及DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶II特异性，肽结合，泛素样蛋白连接酶结合，酰胺结合。由此可以得出，黄芪葛根汤可能是通过调节多个生物过程来治疗糖尿病。

图4 候选化合物与靶点的最优结合模式

图5 GO 富集分析

2.7KEGG通路分析 利用Bioconductor对PPI中的映射靶点进行KEGG通路分析，得到124条通路，对显著性排名前20的通路绘制条形图(见图6)。从结果中可以看出：黄芪葛根汤治疗糖尿病涉及前列腺癌(Prostate cancer)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)信号通路等显著性较高的通路外，还得到17条显著性较高的信号通路。

通过TCMSP数据库筛选黄芪葛根汤有效成分及其对应靶点，构建黄芪葛根汤-有效成分-靶点-疾病关系网络图，寻找候选活性化合物成分。通过STRING数据库构建的蛋白互作网络数据分析得到EGFR,IL6,MYC等是治疗糖尿病排名前三的核心靶点。其中EGFR在胰岛β细胞群的调控方面起着重要作用[12]。IL-6参与免疫等多种生物过程，低浓度表现为免疫调节，高浓度时则会引起病理损伤。对于胰岛素分泌不足引起的高血糖和胰岛素抵抗可以促使胰岛细胞分泌大量的IL-6，过度激活淋巴细胞分化，引起胰岛细胞死亡，加重胰岛素抵抗，导致糖尿病及其并发症[13]。MYC基因是较早发现的一组癌基因，参与细胞增殖分化的调控,有研究表明：高糖可促进原癌基因C-MYC的表达[14]，而C-MYC基因过量表达则会诱发糖尿病心肌细胞病变。

通过将候选活性成分与核心靶点EGFR,IL6,MYC分子对接，得到常春藤皂苷元与EGFR,IL6靶点的亲和能量值最低，即具有较强的亲和力，羽扇豆醇与靶点MYC的亲和能力最强，也说明了黄芪葛根汤治疗糖尿病疾病是通过多成分、多靶点发挥作用。

GO功能富集表明黄芪葛根汤有效成分靶点影响核转录激活剂活性，RNA聚合酶II特异性等过程。KEGG信号通路分析发现黄芪葛根汤主要是通过Prostate cancer,p53 signaling pathway,Fluid shear stress and atherosclerosis信号通路抵抗糖尿病。Prostate cancer信号通路包含AR,NF-κB等主要信号因子。AR信号通路的转导，可以介导雄激素发挥促细胞增殖、分化和转移等作用。NF-κB作为经典的炎症因子，在改善胰岛素抵抗、抑制胰岛β细胞凋亡及降低糖尿病并发症过程中发挥着非常重要的作用[15]。p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，通过Bcl2,Fas,IGF-BP3 等蛋白，完成对细胞凋亡的调控作用[16]。Fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathway通过剪切应力作用于内皮细胞，并激活一系列相关的信号通路，最终调节基因和蛋白表达[17]。此外，AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications信号通路与糖尿病及其并发症的形成有密切关系[18-20]。研究发现过高的AGE可以明显上调胰岛细胞表面RAGE受体的表达，两者结合后可激活氧化酶，促使NF-κB表达，导致胰岛细胞凋亡[21]。

综上所述，本研究借助网络药理学和分子对接探究了黄芪葛根汤治疗糖尿病的作用机制，阐明了黄芪葛根汤治疗糖尿病是通过多成分、多靶点、多通路来实现的。其功效通过候选活性化合物影响关键靶点的表达，调控前列腺癌、流体剪切应力与动脉粥样硬化、p53信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE等信号通路，这些结论也基本与文献报道吻合，为黄芪葛根汤后续实验验证及临床应用提供可靠地理论依据。

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