基于网络药理学预测山茱萸抗肝损伤的作用机制*

姜海慧 张化为 姜祎 宋小妹 黄文丽 许洪波 邓翀

(陕西中医药大学/陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

山茱萸是山茱萸科植物CornusOfficinalisSieb.et Zucc.的成熟果肉[1]。山茱萸味酸，微温，具有补益肝肾、收敛固脱、涩精止汗的作用。主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴。现代药理研究表明，山茱萸具有保肝、抗氧化、神经保护、心肌保护等功效[2-3]。近年来，有研究表明山茱萸环烯醚萜总苷、熊果酸、多糖、没食子酸等成分均有抗肝损伤的作用[4-6]。目前市场上治疗肝炎、肝癌的药物存在疗效低和毒副作用大的问题而限制其临床应用[7-9]，因此抗肝损伤药物的研制是一项艰巨的任务，也是全球研究的热点。中药具有多成分、多靶点和多途径等特点，网络药理学具有整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点，融合了系统生物学、多向药理学及计算机分析技术，能过多层次的阐明药物作用机制[10]。与中医药学的基本特点相吻合，符合中医药对疾病本质的认识，近年来已经成为了中药研究的一种有效的技术手段[11]。本研究将网络药理学构建相互作用网络，预测山茱萸抗肝损伤的潜在作用靶点和分子机制，并通过分子对接技术验证山茱萸活性成分与关键靶点的结合活性，发现山茱萸抗肝损伤有潜在优势，以期为山茱萸的临床应用和基础研究提供新的思路。

1.1活性成分的筛选 以山茱萸为关键词，利用中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP http://tcmspw.com/ tcmsp.php)，化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn)，中药综合数据库(TCMID http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)和中国国家知识基础设施数据库(CNKI,http://www.cnki.net/)搜索山茱萸的化学成分。将OB≥30%和DL≥0.18的化学成分选作进一步分析的候选成分[12-14]。

1.2活性成分相关靶点的筛选 从TCMSP和Swiss检索预测山茱萸中所有成分的蛋白质靶点。删除了多余的信息，使用UniProt(http://www.uniprot.org/)数据库，将数据合并获得靶蛋白规范名称。

1.3山茱萸抗肝损伤相关靶点的筛选 通过GeneCards v4.9.0(www.genecards.org/)和OMIM(www.omim.org/)数据库中整理肝损伤相关疾病靶点。输入关键字“hepatic injury”搜索现在研究已经报道的与肝损伤相关的靶点，将两个数据库得到的靶点去重整理。

通过venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，分别输入山茱萸活性成分的靶点与肝损伤相关的靶点，整理即得活性成分靶点与疾病靶点的交集，将其定义为山茱萸抗肝损伤的潜在靶点。

1.4网络构建与分析 使用Cytoscape v3.7.1(www.cytoscape.org/)对山茱萸的成分、相关靶点进行相互作用网络的绘制。

1.5GO与KEGG分析 在R软件[15]中运行代码对山茱萸抗肝损伤的潜在靶点进行GO和KEGG分析。并根据P值进行排序，保留优选结果。

1.6蛋白相互作用(PPI)网络的构建 根据String v11.0(https://stringdb.org/cgi/input.pl)数据库进行蛋白-蛋白相互作用网络分析[16]，获取蛋白相互作用关系，导入Cytoscape软件绘制靶蛋白的相互作用网络，利用Network Analyzer模块对网络进行分析，以确定在山茱萸治疗中肝损伤潜在靶标之间的关系。

1.7活性成分-靶点分子对接 从RCSB蛋白质数据库PDB(http://www.rcsb.org/pdb/)获得了相应靶点的PDB-ID。采用Discovery Studio 2016软件中LibDock模块进行分子对接，用以评价山茱萸活性成分与靶点之间的结合活性。

2.1活性成分的筛选 通过多个数据库获得山茱萸化学成分333个，使用OB和DL进行筛选，尽管有些成分不符合筛选标准，但通过查阅文献，发现它们有明显的药理活性，例如马钱苷、莫若苷等成分[17]，为了更全面、客观地分析这一问题，仍将其纳入到活性成分数据库里，具体成分见表1。

表1 山茱萸的活性成分

2.2成分靶点筛选 经过TCMSP和Swiss数据库收集的靶点，收录的山茱萸中成分的作用靶点共1639个。将获得的靶点进一步映射到Uniprot数据库归一化和标准化命名，删除无效与重复靶点，共获取山茱萸有效活性成分作用靶点484个。

2.3山茱萸抗肝损伤相关靶点的收集 通过GeneCards数据库与OMIM数据库检索得到3493个与肝损伤相关的基因，通过venny 2.1.0制作韦恩图(见图1)，取得山茱萸活性成分抗肝损伤的相关靶点333个。

图1 山茱萸作用靶点与肝损伤相关靶点交集

2.4网络构建 运用Cytoscape 3.7.1软件构建活性成分-靶点网络，如图2所示，蓝色为活性成分，灰色为相关靶点。图中共364个节点和1107条边。每个活性成分可作用于多个靶点，该网络的平均邻近节点数为5.984，说明山茱萸抗肝损伤的多成分多靶点的特性，图中也可以看出许多靶点也与多种化合物相关，这表明山茱萸在发挥药效过程中不同化合物也具有协同作用。

图2 成分-靶点相互作用网络

2.5GO分析 将333个潜在靶点通过R软件对其进行GO的富集分析(P<0.05)，系统地分析其生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)。共富集到 2728个生物过程(图3)，104个细胞组分(图4)，218个分子功能(图5)。根据P值从小到大截取排名较高的选项，图3中，颜色越红，表示P值越小，排名越高，图3B展示了表示不同生物过程的相关度，相关度越高，边越粗，富集靶点越多，形状越大。图3C展示了根据P值排名前五的生物过程所涉及的靶点。图4和图5同上。结果表明，在生物过程与对细菌起源分子的反应和循环系统中的血管过程等项相关性较高；
在分子功能中与膜筏和膜微区等相关性较高；
在细胞组分中与蛋白酪氨酸激酶活性和核受体活性等相关性较高。反映了肝损伤涉及体内多个生物过程、细胞组分、分子功能的异常，同时表明山茱萸可能是通过调节这些过程可以发挥其抗肝损伤的作用。

A.GO富集生物过程气泡图；
B.GO富集生物过程与潜在靶点关系图

A.GO富集细胞组分气泡图；
B.GO富集细胞组分与潜在靶点关系图

A.GO富集分子功能气泡图；
B.GO富集分子功能与潜在靶点关系图

2.6KEGG通路分析 KEGG途径的富集分析使用R软件(P<0.05)进行(图7)。KEGG途径富集后，将333个潜在靶基因映射到115个途径。根据图6所示，表明这些靶点与AGE-RAGE信号通路，PI3K-Akt信号通路，神经活性配体-受体相互作用、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、内分泌抵抗等信号通路密切相关。通过KEGG Map绘制AGE-RAGE信号通路，PI3K-Akt信号通路，神经活性配体-受体相互作用，HIF-1信号通路的pathway通路图(图7C-F)，同时将涉及到的交集靶点标红。这些途径可能是负责肝损伤治疗的关键途径，提供了研究肝损伤治疗的新方法。

A.KEGG分析条形图;B.KEGG分析柱状图;C.AGE-RAGE信号通路；
D.PI3K-Akt信号传导径

2.7蛋白相互作用分析 将潜在靶点上传至String软件，得到了交集蛋白的相互作用关系，通过Cytoscape3.7.1软件绘制一个由285个节点和1530个边缘组成的靶蛋白的相互作用网络，该网络的平均邻近节点数为6.648。(图7)。

图7 PPI网络

将节点颜色设置用于反映DC(Degree Centrality)的高低，DC值越大，节点颜色越红；
颜色的深浅用于反映BC(Betweenness Centrality)的高低，值越高，节点越大；
字体的大小反应于CC(Closeness Centrality)值的高低，CC值越大，字体越大；
边的颜色反应于Combined Score的大小，值越大，颜色越红；
获得最终的蛋白相互作用网络。结果显示PPI相互作用网络中的DC平均值为10.8754，CC平均值为0.3096，BC平均值为0.0087。经过筛选，45个潜在靶点的三个中心值都高于相关平均值。

2.8分子对接 上述PPI相互作用网络中三个中心值越高，说明在整个网络中占据重要的地位，这些节点被称为“中枢节点”，在山茱萸抗肝损伤过程中发挥着重要的作用。因此我们对上述三个中心值排名均在前十位的核心靶点通过venny获取交集基因，得到PIK3R1、MAPK1、TP53、HSP90AA1四个核心靶点，将其与本研究筛选出来多的32个活性成分进行分子对接验证。从PubChem数据库和ChemDraw中获得山茱萸32个活性成分的smiles字符串；
从RCSB PDB数据库中获得4个重要靶点的晶体结构，PIK3R1晶体结构的PDB ID为4OVV，MAPK1晶体结构的PDB ID为6G54，TP53晶体结构的PDB ID为6MY0，HSP90AA1的PDB ID为1YC3。通过Discovery Studio 2016软件将活性成分和靶蛋白进行准备，加氢、去水、去配体，通过LibDock模块[18]进行批量分子对接，对接分数越高，对接的结合活性越好。删掉没有对接上的成分，保留28个成分的对接分数，制作热图(图8)。结果表明山茱萸新苷、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、3,6-二没食子酰基葡萄糖、路边青鞣质D都有良好的结合活性。图9展示了部分活性成分与4个核心靶点对接示意图。根据这些数据预测了山茱萸化学成分-蛋白质结合亲和力。

图8 分子对接结果-热图

A.HSP90AA1与3,6-二没食子酰基葡萄糖对接;B.TP53与路边青鞣质D对接;C.MAPK1与山茱萸新苷对接;D.PIK3R1与莫诺苷对接

本研究通过网络数据库分析的方法发现山茱萸32个有效活性成分与333个潜在靶点可能存在相互作用关系。对潜在靶点进行GO和KEGG分析得到山茱萸抗肝损伤作用机制的相关通路有AGE-RAGE信号通路，PI3K-Akt信号通路，神经活性配体-受体相互作用、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、内分泌抵抗等信号通路密切相关，通过PPI分析得到PIK3R1、MAPK1、MAPK3、SRC、APP、TP53、AKT1、HRAS、HSP90AA1、MAPK8、JUN、EGFR、LYN、F2、MAPK14等潜在靶点。为了更好研究山茱萸抗肝损伤的药效成分与靶点之间的作用，通过分子对接验证，分子对接结果表明山茱萸新苷、3,6-二没食子酰基葡萄糖、路边青鞣质D、马钱苷、莫诺苷、熊果酸等成分都是山茱萸保肝的关键药效物质基础。

本研究发现山茱萸中山茱萸新苷、3,6-二没食子酰基葡萄糖、路边青鞣质D、马钱苷、莫诺苷、熊果酸等32种潜在活性成分对肝脏损伤具有保护作用和治疗作用，其机制可能与减少炎症因子的生成、抑制酶的活化、抗氧化、清除自由基的能力的提升以及免疫调节等多种途径有关[19]。有研究表明山茱萸多酚和黄酮类成分具有抗菌抗氧化能力，对DPPH自由基、亚硝酸盐自由基、羟基自由基均具有清除作用，且还原能力强，表明了山茱萸较强的抗氧化活性[20-21]。山茱萸总苷等对于CCl4诱导的肝纤维化化模型，在通过降低细胞色素P4502E1的表达，从而抑制了炎症反应，抗氧化应激损伤等作用保护CCl4诱导[22]。山茱萸环烯醚萜苷对免疫反应有双向调节的作用，对浓度高时有抑制作用，浓度适宜时会促进白细胞介素-2(IL-2)的产生，且马钱苷通过抑制Bcl-2蛋白表达，促进Caspase-3、Caspase-9活化从而对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可诱导其凋亡。莫诺苷通过抗氧化应激降低Nrf2，HO-1的表达从而抑制两人HepG2细胞的生长，改善肝细胞的凋亡率、细胞形态[17,23]。

根据蛋白-蛋白相互作用网络分析，可以清晰的看出山茱萸抗肝损伤涉及的PIK3R1、MAPK1、MAPK3等15个潜在活性靶点大多都分布在排名较高的信号通路中，说明这15个靶蛋白为山茱萸抗肝损伤的核心靶点。现已有研究表明，大部分的靶点均与抗肝损伤密切相关，其中，PIK3R1(磷脂酰肌醇3-激酶)多种因子激活，从而参与调节代谢、膜转运、凋亡等生物学过程，对治疗炎症、代谢等疾病作用机制具有显著的作用[24]。丝裂原活化蛋白激酶MAPK1、MAPK3等蛋白影响着VEGF、PPAR等多种信号通路，对血管内皮细胞的分裂、生长和保护有促进作用，山茱萸活性成分可能通过影响MAPK1等酶，从而保护血管内皮和促进血管生成的药效[24]。TP53(肿瘤蛋白P53)能调节细胞周期和避免细胞异变发生，抑制TP53的活性可减轻肝细胞凋亡带来的肝损伤[26]。JUN(氨基端激酶)是促分裂原活化的蛋白激酶，包括JNK1、JNK2、JNK3，JUN对肝细胞增殖以及发育异常的发展具有重要功能，从而影响细胞凋亡、炎症和肿瘤的发生[27]。

山茱萸抗肝损伤相关靶点的KEGG富集分析结果中，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications通路AGE结合其受体(RAGE)发挥作用，并可以诱导成肌纤维细胞分化，从而导致细胞迁移加，调控AGE-RAGE信号通路，可以减轻的肝氧化应激，炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)及其上游介导核因子κB[28]，且AGE-RAGE信号通路与Calcium信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路均有关联。PI3K通过合成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(PI-3,4-P2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5-P3)，从含有PH结构域的蛋白如3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)或其下游靶标Akt，反过来激活mTORC1[29]，抑制细胞自噬，发挥负向调节自噬过程的作用，从而影响细胞分子的活化，促进细胞迁移、血管生成和炎症因子的表达[30]。

综上所述，使用系统网络药理学方法来分析山茱萸抗肝损伤的多成分，多靶点，多通路的作用机制，包括化合物数据库的构建，靶标的捕捞，网络的构建和分析。获得了山茱萸的32个活性成分，333个潜在靶点和115个信号通路。此外，通过进行分子对接验证了化合物与靶标相互作用的可靠性。山茱萸通过网络药理学抗肝损伤作用机制研究路线如图10所示。本文建立的山茱萸通过网络药理学和分子对接探讨抗肝损伤的研究模式，为山茱萸活性成分的筛选和抗肝损伤作用机理的探讨提供了一个研究思路。

图10 山茱萸通过网络药理学抗肝损伤作用机制研究路线图

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