GW4869与Pitstop2抑制发热伴血小板减少综合征病毒胞间传播的效果观察*

张美娜 施明杰 秦 通 孙 毅

(军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室，北京 100071)

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一种蜱媒出血热，长角血蜱Haemaphysalislongicornis被确定为主要的传播媒介(Luoetal., 2015; Huetal., 2020)。SFTS自近10年前出现以来，地理分布范围在不断扩大(Zhanetal., 2017; Tranetal., 2019; Winetal., 2020)，危害人口快速增加，其病死率为12%～50% (Takahashietal., 2014; Kimetal., 2018; Lietal., 2018; Tranetal., 2019)。考虑到主要蜱媒的广泛分布和扩散(Raineyetal., 2018; Miaoetal., 2020)以及通过接触患者血液和/或其他体液的另一种传播潜力(Tangetal., 2013; Kogaetal., 2019; Akagietal., 2020)，SFTS的死亡人数和潜在威胁被低估了。SFTS的病原体为发热伴血小板减少综合征病毒(SFTS virus，SFTSV)(Abudurexitietal., 2019)，在以往研究中，SFTSV被证实是通过网格蛋白介导的内吞或吞噬作用进入细胞(Lozachetal., 2010)。在受体介导的内吞作用(receptor mediated endocytosis，RME)中，细胞表面上的受体靶向特定的货物，当货物内化时则被转运到内体, 货物也可能会被回收至细胞膜，在细胞内运输或输送到溶酶体进行降解(Woodetal., 2021)。网格蛋白介导的内吞作用(clathrin mediated endocytosis，CME)是 RME 研究最多的形式，被认为是细胞中的最主要的内吞过程(Kirchhausen, 2000; Woodetal., 2021)。网格蛋白(clathrin)在真核生物中具有高度进化保守性，其介导的内吞作用调节许多生理过程，包括细胞内运输、有丝分裂、细胞迁移、生长因子和受体内化、病原体入侵和突触传递( Briantetal., 2020; McMahonetal., 2011)等。

一些病毒在长期进化中形成利用胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)发生过程实现病毒传播的机制(Altan-Bonnetetal., 2019)。EVs的大小及内含物组分具有较高的异质性，不同的细胞通过分泌携带不同组分的EVs实现细胞间通讯和信号转导。EVs通过质膜融合、大胞饮作用及网格蛋白的内吞作用被受体细胞吸收，然后通过物质交换或释放内含物，实现物质和信号的交流(Parolinietal., 2009; Commissoetal., 2013; Tianetal., 2014; Kamerkaretal., 2017; Kallurietal., 2020)。除了在疾病方面的特异性诊断与靶向治疗应用外，EVs与病原体互作模式的研究领域已成为分析病原体扩散、传播的重要手段。利用EVs生成途径，病毒的整体或部分核酸、膜蛋白及受体细胞调控小分子(mRNA、miRNA、ncRNA、cirRNA等)，甚至完整病毒颗粒(Silvasetal., 2016)得以从宿主细胞中释放并扩散或传播至新的受体细胞或宿主动物(Andersonetal., 2016; Altan-Bonnetetal., 2019)。EVs除了可以转运病毒及病毒组分，还可运载功能蛋白、转录因子、核酸等生物活性分子，调控受体细胞免疫或者凋亡，为病毒入侵做准备，实现免疫逃避，进而成功入侵机体。几乎所有的真核细胞都会分泌EVs (Raposoetal., 1996；
Zitvogeletal., 1998；
Raposoetal., 2013)，并且EVs天然存在各种体液中 (Kallurietal., 2020)，这一特点再次为EVs介导病原体传播提供研究实证。为此，本研究在已明确EVs介导病原体传播的基础上，采用对维持血管动态平衡起着重要作用的HUVEC细胞对感染SFTSV的Vero细胞分泌的EVs(SFTSV-EVs)与游离的SFTSV的传播速率进行观察，利用网格蛋白抑制剂(Pitstop2)和外泌体合成/释放抑制剂(GW4869)对SFTSV的胞间传播进行抑制，探讨基于EVs抑制SFTSV阻断传播的可能性。

1.1 细胞系和病毒株

细胞系为非洲绿猴肾细胞系(Vero系)、人成角质上皮细胞(HaCaT细胞系)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞系)为本实验室长期传代培养细胞系，冻存于液氮罐中。SFTSV为河南省信阳株，在研究室Ⅱ级生物安全实验室长期扩繁，并冻存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要试剂

胎牛血清(Gibco公司)、去外泌体胎牛血清(SBI公司)、实时荧光定量PCR试剂盒(Promega)、内皮细胞培养基(ScienCell)、DMEM培养基(Gibco)、GW4869(Med Chem Express)、Pitstop2(Med Chem Express)、二甲基亚砜—DMSO(Solarbio)、Viral RNA Isolation Kits(QIGEN)。

1.3 SFTSV-EVs感染动力学分析

为了确认SFTSV-EVs的感染动力学，在感染复数(multiplicity of infection, MOI)=0.001的条件下，用SFTSV-EVs感染HUVEC细胞，加入ECM1001完全培养基，将细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，取感染3、6、12、24、48、72、96 h的下层细胞检测细胞病毒载量。对照组为SFTSV感染，其他实验条件与实验组一致。

1.4 GW4869抑制EVs的释放

依据GW4869试剂使用说明及对文献(Zhouetal., 2018; Regmietal., 2020)的研究方法进行调整，将Vero细胞传至0.4 μm的细胞小室中，在前一天铺好Vero细胞的细胞小室中加入1 mL 10 μmol/L GW4869 37 ℃ 5% CO2培养箱孵育24 h；
将SFTSV-EVs稀释至适合的倍数，每孔细胞小室加入100 μL染毒90 min后用PBS清洗3次；
然后将细胞小室接种在铺好 HaCaT细胞的12孔板中；
在培养6、24、48、72 h取下层细胞检测细胞病毒载量。对照组为DMSO组，其他实验条件与实验组(GW4869组)一致。

1.5 Pitstop2抑制SFTSV的传播

按照Pitstop2试剂使用说明和文献(Zhouetal., 2018)进行方法优化，将Vero细胞传至12孔板中，培养24 h后分别加入1 mL 15、30、45 μmol/L Pitstop2 并于37 ℃ 5% CO2培养箱孵育15 min；
然后再将SFTSV-EVs稀释至适合的倍数，每孔细胞小室加入200 μL染毒90 min后用PBS清洗3次；
加入1 mL细胞维持液培养72 h后，用PBS清洗3次后，检测细胞病毒载量。对照组为DMSO组，其他实验条件与Pitstop2组一致。

按照细胞培养的操作方法，将Vero细胞传至0.4 μm的细胞小室中，在前一天铺好Vero细胞的细胞小室中加入1 mL 15 μmol/L GW4869 37 ℃ 5% CO2培养箱孵育15 min；
将SFTSV-EVs稀释至适合的倍数，每孔细胞小室加入200 μL染毒90 min后用PBS清洗3次；
然后将细胞小室接种在铺好 HaCaT细胞的12孔板中；
在6、24、48、72 h用PBS清洗3次后，取下层细胞检测细胞病毒载量。对照组为DMSO组，其他实验条件与Pitstop2组一致。细胞病毒载量的检测方法，参照文献(Huetal., 2020)及试剂使用说明进行。

1.6 统计方法

采用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据处理及统计，资料服从正态分布，采用均值形式描述，组间比较采用独立样本t检验。SFTSV 载量分析多组间方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以双侧P<0.05和P<0.01为显著和极显著差异统计学意义。

2.1 SFTSV-EVs与SFTSV侵染宿主细胞动力学分析

在SFTSV-EVs感染HUVEC动力学分析中，研究发现在3、6、12、24 h这4个时间点，SFTSV-EVs组细胞病毒载量明显高于SFTSV组，并在后续时间点(48、72、96 h)均高于SFTSV组，但在48 h后SFTSV-EVs组与SFTSV组病毒增殖都进入平台期，之后二者病毒含量越来越接近(图1)。值得注意的是，在染毒培养后第3 h时，对SFTSV-EVs组与游离的SFTSV组的细胞病毒载量进行统计学分析，在3、6、12、24、48、72和96 h两组的细胞病毒载量差异均具有统计学意义(P<0.05)。且在3 h时SFTSV-EVs组细胞病毒载量是SFTSV组的2.292倍(图1)。

图1 SFTSV-EVs与SFTSV侵染HUVEC细胞动力分析

2.2 GW4869抑制EVs介导的SFTSV传播分析

将含有SFTSV的EVs接种于10 μmol/L GW4869作用24 h后的Vero细胞，然后与下层HaCaT细胞共培养，取不同时间点的HaCaT细胞检测细胞病毒载量，取SFTSV RNA拷贝数的对数进行比较，GW4869组与DMSO组差异具有统计学意义(F=154.389，P<0.01)，时间点6、24、48、72 h组间比较差异同样具有统计学意义(F=3472.814，P<0.01)。对照组DMSO组的细胞SFTSV载量随着时间的增加呈现递增的趋势，而GW4869组的细胞SFTSV载量先是随着时间增加而增加，在第24 h这一时间点细胞SFTSV载量达到一个最低点，之后细胞病毒载量又随着时间的增加而增加(图2)。在24 h内GW4869抑制效果先是随着时间增加而增强，24 h后则随时间增加逐渐降低。

图2 GW4869对EVs介导的SFTSV传播的抑制分析

2.3 Pitstop2抑制网格蛋白介导的SFTSV传播分析

结果发现，同一培养时间条件下，30 μmol/L Pitstop2抑制效果最佳(图3-a)。据此进一步分析Pitstop2的最佳抑制时间，可以发现，将含有SFTSV的胞EVs接种于不同浓度Pitstop2处理15 min后的Vero细胞，然后连续培养72 h并于6、24、48、72 h分别检测Vero细胞SFTSV病毒载量，对比SFTSV RNA拷贝数，发现Pitstop2组与DMSO组的病毒载量都是先随着时间的增加而增加，而后在培养24 h后病毒载量开始降低，并在培养72 h时，Pitstop2组的病毒载量明显低于DMSO组，这表明30 μmol/L Pitstop2作用15 min后培养72 h的抑制效果最佳，能够有效抑制SFTSV的感染(图3-b)。

图3 Pitstop2对SFTSV传播的抑制研究

蜱媒病毒以跨物种适应和传播的特性，成为解读病毒性传染病传播共性规律、开展传播阻断新技术研发的典型代表。目前，有很多研究采用遗传与化学方法来阻止网格蛋白依赖性传播途径(Hauckeetal., 2018)：如研究人员通过RNA干扰技术阻止细胞中的网格蛋白生成，结果发现，在没有网格蛋白的情况下，细胞分裂会变得像在癌症等疾病中的细胞一样，极不规律(Brodsky, 2012)。研究证实，SFTSV大多都是通过网格蛋白的内吞作用进入细胞(Lozachetal., 2010)，Pitstop 2 是一种网格蛋白抑制剂，可通过与网格蛋白的末端域相关联来抑制网格蛋白介导的内吞作用，本研究利用Pitstop2选择性地抑制配体与网格蛋白末端域的结合特点，通过抑制SFTSV在细胞内形成包涵体结构，进而有效抑制SFTSV的传播。

与其他布尼亚病毒非结构蛋白NSs不同，SFTSV-NSs与IFN反应的多种成分相互作用，并将其重新定位到细胞质结构中(Jungbauer, 2018)。已知双链RNA、病毒蛋白NP和L均参与SFTSV的复制，可共同存在于囊泡中(Altan-Bonnetetal., 2019)。这些囊泡也被发现与脂滴共存(Wuetal., 2014)。此外，影响脂肪酸合成的抑制剂对这些棘突状结构的形成以及病毒复制都有负面影响(Wuetal., 2014)。这些研究为这些结构的来源提供了初步证据，但对于这些结构是如何包装病毒RNA并在细胞内运输，以及如何在MVB中结合糖蛋白形成具有感染性的病毒粒子目前仍不清楚。研究发现，SFTSV相关的EVs被释放至细胞外，并被邻近细胞所摄取，这是一种新的由EVs介导的SFTSV传播模式，其感染宿主细胞可能是经过EVs膜与宿主细胞膜相融合而释放囊泡内含物作用，或者EVs与宿主细胞表面受体相结合而相互作用，亦或者直接通过巨胞饮进入宿主细胞而作用。

本研究通过对EVs介导的SFTSV与游离的SFTSV传播速率进行观察，发现SFTSV-EVs感染HUVEC细胞后3 h时就形成了大范围的侵染增殖。相比于游离的SFTSV来说，SFTSV-EVs能够更快地侵染宿主细胞，并在较短的感染时间内形成大量增殖，表明EVs介导的SFTSV传播可使得SFTSV在短时间内实现大量复制增殖，传播速率明显高于游离SFTSV，这可能是因为SFTSV是通过网格蛋白受体依赖性传播，而EVs介导的SFTSV传播是通过不依赖于网格蛋白的内吞作用和巨噬细胞吞噬作用进入细胞，亦或者是因为EVs膜与宿主膜的同质性而直接融合进入细胞 (Costa Verderaetal., 2017; Shafaq-Zadahetal., 2020)。而随着共培养时间的增加，SFTSV-EVs组与SFTSV组病毒增殖都进入平台期，之后二者病毒含量越来越接近，可能是因为宿主细胞在感染游离的SFTSV后也会产生SFTSV-EVs，并且新产生的SFTSV-EVs又会重新侵染HUVEC细胞，因而，随着SFTSV-EVs与游离的SFTSV侵染宿主细胞后培养的时间越长，两者病毒载量越接近。GW4869是非竞争性的中性鞘磷脂(N-Smase)抑制剂，也称EVs合成/释放抑制剂，可以通过抑制神经酰胺水解从而抑制囊泡的形成。本研究通过观察GW4869对SFTSV传播的抑制效果，发现10 μmol/L 的GW4869对SFTSV增殖抑制具有时段效应，24 h时抑制效果最佳。GW4869可以在浓度依赖的条件下保护细胞免于死亡并抑制神经酰胺(SM)被水解途径形成囊泡，能够有效抑制SFTSV的感染传播。

这种由EVs所介导的SFTSV传播模式是一种非受体依赖性传播模式，区别于以往的网格蛋白依赖性传播模式，这种新的病毒传播模式具有更快的时效性、更高的宿主适应性及更广泛的宿主谱(Zhouetal., 2018)，且可以使病毒完美地实现对中和抗体胁迫的免疫逃逸(Andersonetal., 2016)。这提示由EVs发生途径入手可以开发出更有效的病原体传播防控策略，未来需要对EVs的发生机制及转运途径进行深入研究，以期找到更多科学、有效地抑制病原体传播及治疗的新策略，以推动以传播阻断为主要方式的虫媒病预防策略和防控新技术的发展。

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