云南松花粉中总黄酮和总酚含量的株间差异研究*

付玉嫔,陈少瑜,李思广,罗婷 ，周云，李志华，李少文

(1.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201；
2.云南省森林植物培育与开发利用实验室，云南 昆明 650201；
3.富民县林业和草原局，云南 富民 650400；
4.马关县金城国有林林场，云南 马关663700)

云南松(Pinusyunnanesis)属松科(Pinaceae)松属(PinusL.)常绿针叶乔木,生长快,材质好,耐干旱瘠薄,天然更新能力强,是西南地区荒山造林先锋树种和主要的用材树种，广泛分布在云南，少量也见于四川、西藏、贵州和广西[1-2]。松花粉为松属植物的雄性生殖细胞(雄配子体)，是最早被人类食用的非蜂源纯净花粉。松花粉作为药材、食材的历史悠久，早在汉代的《神农本草》中即有记载，之后唐代的《新修本草》和明代的《本草纲目》等医书中也多有记录。然而，因植物花粉产量较小、收集不易、对其有效成分提取成本高等原因，仅有马尾松(P.massoniana)、油松(P.tabulaeformis)和云南松等几个分布面积较广的松属树种的花粉利用较多，各产区也纷纷开展了相关研究[3-7]。云南松作为云南省分布面积较为广泛的重要树种资源，其林分生物量变化[8]、林下草本植物多样性分布格局[9]、林分分布格局[10]等研究较多，而对其花粉的研究则主要集中在营养成分和生物活性物质分析[11-13]、功效及安全性实验测定[14]、开发利用技术研究[15-16]等。云南松花粉含有几乎人体所需要的全部营养物质[14]，其中黄酮类物质和酚类物质被广泛认为是花粉中的重要生物活性成分，具有抗氧化和清除自由基功能。因此，云南松花粉除作为遗传改良的基本物质外，还可作为保健功能食品且具有较大的开发利用价值。

目前，云南松花粉原料均采自云南松天然林分，因云南松树体高大其花粉不容易采集，采用的是杀鸡取卵式的采粉方式——将开花树枝砍下甚至整个植株砍倒采收，对森林破坏严重，因此当地林业部门纷纷出台相关政策、法规禁止花粉采收以保护森林。为更好地利用这一天然资源，有必要进行花粉产量和质量较高的优良种质资源的选育，以营建优质、高产花粉原料林，使松花粉产业可以持续健康发展。关于云南松的花粉形态[17]、花粉储藏及萌发条件[18]、花粉活性成分[14,19]等的研究已有报道，但云南松花粉优树选择方面尚无报道。本文通过对不同云南松单株花粉中重要的功能性物质——总黄酮及总酚——进行测定，以了解单株之间花粉功能性物质的差异性，为云南松花粉单株选择提供基础数据。

1.1 花粉收集

2021年3月份收集树龄30～31 a、处于盛花期的17个云南松单株的成熟花粉。其中，8个单株采自楚雄市子午镇，其余9个单株采自宜良县小哨林区(表1)。每个单株收集10个成熟即将散粉的雄球花，用牛皮纸袋盛放置于室内通风干燥处阴干，注意避免花粉污染，然后过250目筛，收集纯净花粉留待检测。

表1 17个云南松采样单株的地理分布信息

1.2 生长量和产粉性状指标数据收集

测量17个单株的树高(精确到0.1 m)、胸径(精确到0.1 cm)、冠幅(精确到0.1 m)等生长量指标和雄球花鲜重(精确到0.1 g)、雄球花产粉量(精确到0.01 g)、雄球花粗和长(皆精确到0.01 cm)、小孢子叶粗和长(皆精确到0.01cm)等产粉性状指标。每个单株平行取样3份重复测定总酚含量和总黄酮含量。

1.3 总酚含量和总黄酮含量测定

1.3.1 样品溶液制备

称取约 0.1 g 新鲜花粉在 105 ℃下杀青 3 min；
于 60 ℃烘干至恒重；
粉碎，过 40～60 目筛，得到烘干样本；
取所有烘干样本加入 1.5 mL 的 60%乙醇，于60 ℃振荡提取2 h；
25 ℃、12 000 rpm离心 10 min；
取上清液，用 60%乙醇定容至 1.5 mL，待测。

1.3.2 测定方法

应用苏州格锐思生物科技有限公司(Suzhou Grace Biotechnolgy Co.，Ltd)的试剂盒，采用酶标法测定。总酚测定试剂盒采用福林酚法测定总酚含量，总黄酮测定试剂盒采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法测定黄酮总含量。

测定所用仪器和物品为：美国MD190酶标仪、96 孔板、低温离心机TLG-16(湖南湘仪)、可调式移液器、粉碎仪、烘箱、筛子、60%乙醇、蒸馏水。

1.3.3 总黄酮含量测定

(1)标准曲线建立 向标准品(芦丁) EP 管里面加入 1 mL 的 60%乙醇提取液，制备成标准品母液(1 mg/mL)。

把母液用 60%乙醇稀释成5个浓度梯度的标准品(0、 0.2、 0.4、0.6、0.8、1 mg/mL)。依据测定管的加样体系操作，根据测定结果制作标准曲线。以标准品浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得总黄酮标准曲线方程y=1.6 27 7x-0.004 9，其中：R2=0.999 9；
x是标准品浓度(mg/mL)，y是ΔA；
测定 510 nm 处吸光值为A，ΔA=A 测定-A 空白。样品测定按试剂盒说明进行。

图1 芦丁标准曲线

(2)总黄酮含量计算 总黄酮含量(mg/g 干重)=[(ΔA+0.004 9)/1.627 7×V1]/(V1/V×W) ×D=0.6×(ΔA+0.0049)/W×V×D

式中：V为提取液体积(1.5 mL)，V1为反应中样品体积(0.05 mL)，W为样品质量(g)，D为稀释倍数(未稀释即为1)。

1.3.4 总酚(TP)含量测定

(1)标准曲线建立 向标准品(没食子酸) EP 管里面加入1 mL蒸馏水，超声完全溶解，制成标准品母液(1 mg/mL)。把母液用蒸馏水稀释成5个浓度梯度的标准品：0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL。依据测定管的加样体系操作，根据结果制作标准曲线。得总酚标准曲线方程为：y=0.349 4x-0.000 6，R2=0.999 9，x是标准品质量(μg)，y是ΔA。测定760 nm吸光值 A，ΔA=A测定-A空白。样品测定按试剂盒说明进行。

图2 没食子酸标准曲线

总酚(TP)含量(mg/g 干重)=(ΔA+0.000 6)÷0.349 4×10 -3 ÷(V1÷V×W)×D=0.286 2×(ΔA+0.000 6) ×V÷W×D

式中：V为加入提取液体积,V1为反应中样品体积(0.01 mL),D为稀释倍数(未稀释即为1),W为样品质量(g)。

1.4 数据处理

数据采用Excell和SPSS 18.0软件进行方差分析和制图。

2.1 总黄酮含量

总黄酮即黄酮类化合物，是植物重要的一类次生代谢产物，具有有较强的抗氧化活性，可捕捉活性氧自由基，降低氧化伤害，在果实中影响其色泽和风味。云南松破壁花粉中其含量较高，最高可达6.35 mg/g[14]。云南松17个单株其花粉中的总黄酮含量在2.685～3.864 mg/g之间，单株间存在极显著的差异(P<0.01)(表2)，极差为1.179 mg/g，最大值较最小值高出43.9%；
楚雄和宜良2个种源间花粉中的总黄酮含量差异不显著(P>0.05)。

表2 17个单株花粉总酚含量及总黄酮含量方差分析

2.2 总酚含量

总酚也是一类具有抗氧化和清除自由基功能的活性物质。云南松花粉中的总酚含量在单株间呈极显著的差异(P<0.01)(表2)，17个单株其花粉中的总酚含量在4.24～7.71 mg/g间，极差为3.47 mg/g，最大值比最小值高出了81.8%；
楚雄和宜良2个种源间花粉中的总酚含量差异不显著(P>0.05)。

2.3 总黄酮含量与总酚含量的关系

对17个单株的总黄酮和总酚含量(图3)进行相关性分析，二者在α=0.01 水平上呈显著正相关，相关系数为0.626。

图3 不同单株花粉中的总黄酮含量及总酚含量

对二者进行回归曲线拟合(图4)，可以看出二者间呈线性关系，因此建立二者的一元线性回归方程为y=1.847+0.239x，其中：R=0.626、P<0.01；
y为总黄酮含量，x为总酚含量。两者呈直线线性关系，经检验，其回归系数差异显著(P<0.01)，表明二者显著正相关，和相关分析的结果一致；
从图5可以看出回归标准化残差在零值附近呈正态分布，图6显示二者之间呈线性分布。由此可以推断，回归方程满足线性以及方差齐次的检验，能较好地描述二者间的关系。因此，云南松花粉中总黄酮含量具有随总酚含量增加而增加的特征。

图4 总酚含量与总黄酮含量回归曲线拟合

图5 总黄酮含量回归曲线标准化残差的正态曲线

图6 总黄酮含量回归曲线标准化残差的标准P-P

2.4 总黄酮和总酚与生长指标和产粉指标的关系

表3列出了17个云南松单株的生长指标值和雄球花各个花部特征的平均值。分析云南松成熟花粉中总黄酮含量、总酚含量与产粉指标和生长指标的关系(表4)，发现总黄酮、总酚与雄球花粗呈显著正相关(P=0.008、P<0.01)，总酚与小孢子叶长呈显著正相关(P=0.006)，与雄球花鲜重在0.05水平呈显著正相关，与其他产粉指标相关性不显著；
总黄酮与雄球花花粉量在α=0.05水平呈显著负相关，与其他产粉指标相关性不显著。总酚含量与云南松的树高、胸径、冠幅都呈显著的正相关(P=0.002、P=0.008、P<0.01)，相关系数分别为0.685、0.657、0.761；
总黄酮含量与各生长指标的相关性均不显著。说明总酚与云南松的生长状况和雄球花的发育状况都有密切的关系，但总黄酮含量受云南松的生长影响较小，仅与雄球花粗壮程度密切相关。

表3 17个云南松单株的生长指标和雄球花的花部特征平均值

表4 总黄酮和总酚与生长指标和产粉指标的相关性分析

松花粉作为“微型营养库”，其化学成分中含有黄酮类、不饱和脂肪酸、微量元素等人体需要的营养物质，具有抗氧化、抗疲劳、抗癌抑癌、保肝护肝、降血糖、增强免疫力等功能性特点，是较好的抗氧化剂食品，但其营养物质含量可能受采粉树种类、年龄、花粉成熟程度、花粉活力、个体、地理分布等因素影响而有所差异[20]。

云南松17个单株成熟花粉的总酚含量最高的单株其含量可达7.71 mg/g，较最低单株高出81.8%，最高的总黄酮含量达3.864 mg/g，较最差单株高出43.9%；
总黄酮含量和总酚含量在单株间差异均极显著，P值均小于0.01；
种源间差异均不显著。因此，基于总黄酮含量或总酚含量的花粉优良种质选择不适合群体选择，适合进行个体选择。

云南松成熟花粉中总酚含量与总黄酮含量呈正相关关系，表现出总黄酮含量随总酚含量增加而增加的趋势，因此在云南松花粉质量评定时总酚和总黄酮含量2个功能性指标测定一个即可。此外，总酚含量与云南松植株的高、胸径、冠幅等生长指标和雄球花的粗壮程度均有极显著的相关性，但总黄酮含量则与云南松生长指标相关性不显著，仅与雄球花粗壮程度紧密相关。因此，在开展云南松花粉优株选择时，除考虑生长指标、单株花粉量和花粉品质外，雄球花的粗壮程度应作为重要考虑的指标纳入选择指标中。

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