OsPM1基因在水稻苗期受非生物胁迫响应时的作用及应用

安 硕,姚玲娅,张 鹏,胡 悦,葛晓春

(1.复旦大学 生命科学学院,上海 200438;2.复旦大学遗传工程国家重点实验室,上海 200438)

水稻为地球上35亿多人口提供主食,其种植遍及全球多个农业气候区[1]。我国地处北温带和热带,地理跨度大,但是北到黑龙江,南到海南均以水稻为主栽作物。由于各种植区地理和气候条件千变万化,水稻在其生长过程中可能会遭受各种环境因素的胁迫,包括干旱、高盐、高低温等,它们均可能对水稻的生长和产量造成严重影响[2-5]。水稻喜温却不耐热,最佳生长环境温度在28～30℃,气温如果持续超过35℃,会导致大部分品种产量下降而且品质变差。随着全球人口膨胀和工业化程度的加深,碳排放加剧,从长远来看,全球气温将处于上升趋势。对于气候变暖后果的预测表明,高温可能会严重影响亚洲包括我国的水稻种植,导致水稻的产量大幅下降[6]。我国大部分人口均以水稻为主食,对稻米的需求量尤其巨大,开展水稻抗逆研究,尤其是耐高温新品种的培育对于国计民生来说至关重要。寻找植物抗逆尤其是耐高温基因,通过分子育种技术将相关基因转入水稻栽培品种中,改良水稻的耐逆性,是稳定异常气候条件下粮食作物产量的重要手段。

本实验室前期发现并报道了一个干旱胁迫响应基因OsPM1,该基因编码一个细胞膜蛋白,可以向细胞内转运ABA,从而影响气孔导度,调控水稻对干旱的耐受能力[7]。过表达OsPM1的转基因植株显示出较强的耐旱性[7]。ABA作为植物的逆境激素,在应对干旱、高盐、高温等多种非生物胁迫的应答中都发挥着重要作用[8-10]。在正常生长条件下,ABA在体内的含量较低,PP2Cs磷酸酶与Sn RK2s蛋白激酶结合并抑制后者的激酶活性,ABA信号通路被抑制;在胁迫条件下,植物体内ABA大幅增多并与ABA受体(PYR/PYL/RACR)结合,受体发生构象改变,然后与PP2Cs磷酸酶结合形成三元复合体,从而释放出SnRK2s蛋白激酶,使得其活性被激活,SnRK2s激活后磷酸化下游的离子通道或转录因子,进而改变细胞内的离子浓度或调控下游一系列基因的表达[9-13]。OsPM1作为ABA转运蛋白,影响了细胞内ABA水平,从而影响植物的逆境响应,我们在前期工作中仅仅报道了OsPM1过表达的抗旱表型和其作用机理[7],但由于ABA激素的重要性和在逆境响应中的广泛性,我们推测OsPM1过表达除了增强水稻的耐旱性外,可能还影响了水稻耐受其他非生物逆境的能力,但是否如此需要进一步的实验证实。

在植物逆境响应过程中,转录因子可以与下游基因启动子上的顺式作用元件结合,从而激活或者抑制下游基因的表达。第一个调控热胁迫反应的转录因子是在酵母中鉴定到的,被命名为热休克转录因子(Heat shock transcription factors,Hsfs)[14]。Hsfs在植物的热应激反应中具有重要功能,它可以与热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)基因上游的热休克元件(Heat Shock Elements,HSEs)结合[15-22]。除了热胁迫之外,还有人发现Hsfs的表达增强了植物耐受其他非生物胁迫包括氧化、高盐、冷胁迫的能力[23]。番茄过表达自身的HsfA1时,具有更强的耐热性[24]。在拟南芥中过表达AtHsfA2时,其对热胁迫和氧化胁迫的耐受性均增强[25]。为了增强水稻的耐热性,将热胁迫转录因子置于一个逆境高度响应的启动子之后,提高热胁迫下转录因子的表达水平,并避免其在正常条件下的高表达,则有可能既提高水稻的耐热性,又不影响其在正常条件下的生长发育。高粱是禾本科植物中一类耐热性较强的作物,其热休克转录因子在调节其耐热性上起重要作用。我们推测,在水稻中异源表达高粱的Hsfs家族基因,并控制其在正常情况下的表达,很可能获得具有较高耐热性的水稻品种。

1.1 植物材料、菌株与载体

实验水稻(OryzasativaL.)均为粳稻日本晴,OsPM1及OsPM1::SbHsf03的转基因株系均以日本晴为背景构建;大肠杆菌菌株为E.coliDH5α;农杆菌菌株为AgrobacteriumEHA105;植物转基因载体为p CAMBIA1301ubi、pCAMBIA1302;双萤光素酶报告系统载体为p CHF3、p GreenⅡ0800-LUC。

1.2 方法

1.2.1 胁迫处理

RT-qPCR实验中胁迫处理:水稻种子用3%双氧水消毒0.5 h,然后用蒸馏水洗3遍,置蒸馏水中,于室温泡种两天至露白,将刚刚露白的种子放入底部有孔的96孔板中,每一个孔放入一粒种子,放在盛有水稻营养液(木村B)的枪头盒中培养(28℃,16 h光照/8 h黑暗),至三叶期后进行不同胁迫处理。分别用20%PEG处理24 h、200 mmol/L NaCl处理24 h、50μmol/L ABA处理12 h、45℃处理4 h、0℃处理4 h,处理结束后收集水稻叶片,同时取未处理的水稻叶片作对照,重复3次取样。另外,为了观察OsPM1对热处理的时间响应曲线,将三叶期幼苗在45℃下热处理不同时间后取样。

OsPM1转基因株系胁迫处理:各株系种子去壳后先用70%的乙醇浸泡1 min,再用50%的次氯酸钠浸泡20 min,然后用无菌水清洗3次并铺于滤纸上晾干,清洗过程在超净工作台中进行。准备MS的对照平板、添加了200 mmol/L NaCl的高盐胁迫平板和添加了5%甘露醇的渗透胁迫平板。将晾干的种子放入各平板中,在培养箱中培养12 d后拍照并测量苗长,比较正常平板上和胁迫平板上的生长差异。热胁迫处理:将在营养液中生长14 d的水稻放入45℃的高温培养箱中继续培养4 d(RNAi株系)和5 d(过表达株系)(12 h 45℃光照/12 h 28℃黑暗),观察植株表型,检测正常条件下及高温处理条件下植物的离子泄漏率。

OsPM1::SbHsf03重组基因转基因株系热胁迫处理:将正常条件下生长两周的转基因幼苗转入45℃高温培养箱中继续培养,46 h后观察植株表型,并统计卷叶率,检测处理前及高温处理后植物的丙二醛(MDA)含量及离子泄漏率。长期热处理:将正常条件下生长两周的转基因幼苗转入45℃高温培养箱中继续培养1个月(6 h 45℃光照/18 h 28℃黑暗),之后观察表型。

1.2.2 转基因植物构建

OsPM1过表达株系及RNAi株系由本实验室构建[7]。

OsPM1::SbHsf03融合基因转基因株系的构建:从高粱叶片的总RNA中通过反转录PCR扩增SbHsf03cDNA全长,连入中间载体PCR-Blunt中,然后将SbHsf03、eGFP基因及OsPM1基因上游2 152 bp长的启动子连接到pCAMBIA1302载体中,测序正确后送武汉伯远公司进行水稻日本晴转化。

1.2.3 水稻叶片RNA抽提及实时荧光定量PCR

利用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,用PrimeScript RT-PCR Kit with gDNA eraser试剂盒(Ta KaRa,日本)将1μg RNA反转录成cDNA,以cDNA为模板用SYBR Green Master Mix试剂盒(YEASEN,中国)进行RT-qPCR检测,OsUBQ5作为内参基因,引物见表1。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量测定

取待测水稻叶片0.075 g(植物组织鲜重记为m鲜)放入2 mL离心管中,加入两颗钢珠,在液氮中打成粉末。向离心管中加入2 mL 10%TCA(三氯乙酸)(提取液体积记为V)与植物混匀后静置10 min。静置后用10 000×g的转速离心15 min。取1 m L上清与1 m L 0.6%硫代巴比妥酸混合后于95℃加热30 min并立刻于冰上降温。将冷却后的反应液用10 000×g的转速离心10 min。取上清用分光光度计测532 nm、600 nm、450 nm吸光度值并分别记为A532、A600、A450,计算MDA含量。MDA的质量摩尔浓度bMDA(μmol/g)=(6.45(A532-A600)-0.56A450)×V/m鲜。每个株系进行3次生物学重复。

1.2.5 离子泄漏率检测

取各株系叶片若干于5 m L离心管中,其中已提前加入4 m L蒸馏水,将叶片浸没到水中,放置过夜。次日,将离心管上下颠倒几次,检测溶液的电导率,记为E0。然后将含有材料的离心管放入100℃的沸水浴中煮15 min。待溶液温度降到室温上下颠倒几次重新检测其电导率,记为E1。相对离子泄漏率=E0/E1×100%。每个株系3个重复。

1.2.6 双萤光素酶报告系统检测

载体构建:将OsPM1的启动子(718 bp)连接到双萤光素酶报告系统载体p GreenⅡ0800-LUC中;将编码水稻热休克转录因子的基因(OsHsf)连接到pCHF3中。

水稻原生质体制备:配制酶解液(1.5%Cellulase R-10、0.5%Macerozyme R-10、0.6 mol/L Mannitol、10 mmol/L MES)后先于55℃水浴10 min,温度降到室温后添加1 mmol/L CaCl2、5μmol/Lβ-巯基乙醇、0.1%BSA,然后调p H至5.7,再用0.45μm的滤膜过滤至锥形瓶中待用。取大小适宜的水稻苗叶鞘部分切成小于1 mm的小段放入酶解液中,真空抽气20 min两次,然后放入28℃的摇床中55 r/min避光酶解4 h。酶解结束后向锥形瓶中加入与酶解液等体积的4℃预冷的W5反应液(154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MES,定容后调p H至5.7,用0.45μm滤膜过滤,4℃保存)轻轻搅拌,搅拌后用专用滤网过滤,然后200×g低温离心2～3 min。倒去上清后将离心管底部的原生质体用W5反应液重悬洗涤一次,再将原生质体用W5反应液稀释后放在冰上静置30 min。然后200×g离心3 min,弃上清,用MMG反应液(4 mmol/L MES、0.4 mmol/L Mannitol、15 mmol/L MgCl2,定容后调p H至5.7,用0.45μm滤膜过滤,4℃保存)将原生质体的浓度调至(1～2)×105个/m L。

原生质体转化:将上述构建的两个质粒加入100μL原生质体中,加入120μL 40%PEG4000(40%PEG4000、0.2 mmol/L Mannitol、0.1 mmol/L CaCl2),混匀,放入28℃烘箱中黑暗静置15 min。静置后加入480μL W5反应液混匀并用200×g的转速离心3 min,吸走上清后用1 m L W5反应液洗涤一次,洗涤后的原生质体用100μL W5反应液重悬并转移到已经加入900μL W5反应液的细胞板中,28℃黑暗培养过夜(12～16 h)。

荧光强度检测:次日,将细胞板中的原生质体移至2 m L离心管中并用200×g的转速离心3 min,吸走上清。然后用Dual-Luciferase®Reporter Assay System(Promega,美国)试剂盒检测。加入LARII后检测Luminescence发光值记为LUC,加入Stop&Glo Reagent后检测Luminescence发光值记为REN,LUC/REN的比值代表OsPM1启动子的相对转录活性。以不连接OsHsf的空载体质粒共转化连接OsPM1启动子(718 bp)的双萤光素酶报告系统载体质粒组为对照。

2.1 OsPM1受各种非生物胁迫的诱导并能够被热休克转录因子激活

为了探究OsPM1在水稻各种非生物胁迫中是否发挥功能,我们首先观察了各种胁迫处理后OsPM1在水稻叶片中的表达情况。发现除冷胁迫处理(0℃)外,干旱、渗透、高盐、高温这些非生物胁迫均可以诱导OsPM1在水稻叶片中的表达,最高可达1 000倍以上(图1(a)),暗示OsPM1很可能也在除干旱外的其他非生物胁迫中发挥功能。利用45℃处理生长到三叶期的幼苗不同时间,发现热处理后4 h,OsPM1的表达水平可以达到处理前的300倍以上,其他时间点也有一定倍数的诱导表达(图1(b)),表明OsPM1与水稻热胁迫有关。为了研究OsPM1在水稻热胁迫中的转录调控机制,将OsPM1的启动子(718 bp)连接到双萤光素酶报告系统载体p GreenⅡ0800-LUC中,将其与35S启动子驱动编码水稻热休克转录因子基因(OsHsf)的质粒共转化水稻原生质体(图1(c)),然后用双萤光素酶报告系统检测OsPM1的相对转录活性。结果显示,Os Hsf A2b、Os Hsf A2e、Os Hsf A3均可在一定程度上激活OsPM1的转录,其中Os Hsf A3对OsPM1的转录激活高达11倍(图1(d))。说明OsPM1受热胁迫诱导可能是通过热休克转录因子的直接或间接激活实现的。

图1 各种胁迫处理后OsPM1在水稻叶片中的表达变化及热休克转录因子对OsPM1的转录调控Fig.1 Expression of OsPM1 in rice leaves under various stress treatments and transcriptional regulation of Hsfs on OsPM1

2.2 过表达OsPM1能够提高水稻耐受渗透胁迫和高盐胁迫的能力

进一步对OsPM1的过表达株系OE-2、OE-13、OE-15和RNAi株系RNAi-1,RNAi-3和RNAi-12进行渗透胁迫(5%甘露醇)和高盐胁迫(200 mmol/L NaCl)。结果如图2所示,在正常培养基上各株系长势一致;在含有5%甘露醇的渗透胁迫培养基上生长,过表达株系相比于野生型苗长更长,RNAi株系最短;在200 mmol/L NaCl培养基上RNAi株系生长也慢于野生型。该结果表明,OsPM1在水稻抵御渗透和高盐胁迫过程中也发挥重要功能,过表达OsPM1能够提高水稻耐受渗透胁迫和高盐胁迫的能力。

图2 渗透及高盐胁迫处理下各转基因水稻株系表型分析Fig.2 Phenotype analysis of transgenic rice lines under osmotic and high salt stress

2.3 过表达OsPM1能够提高水稻耐高温能力

将三叶期的野生型、OsPM1过表达(OE-2、OE-13)和RNAi(RNAi-1、RNAi-3)水稻苗高温处理后观察植株表型,发现过表达植株的叶片比野生型绿而RNAi植株的叶片则比野生型更黄(图3(a),见第390页),同时检测了正常条件下及高温处理条件下各株系植物的离子泄漏率,结果显示:相较野生型,过表达株系的离子泄漏率较低,而RNAi株系的则较高(图3(b),见第390页)。上述结果说明OsPM1也参与了水稻抗高温反应,过表达OsPM1可以增强水稻的耐热性。因此,OsPM1基因在改善作物耐热性上具有很好的应用前景。

图3 高温胁迫处理下各转基因水稻株系表型分析Fig.3 Phenotype analysis of rice transgenic lines under high temperature

2.4 OsPM1::Sb Hsf03融合基因转基因株系的构建

OsPM1启动子是一个胁迫诱导型启动子,在面临干旱、高温等逆境时,其活性常常提高几百倍以上,而在正常生长条件下,该启动子的活性则很低。高粱是禾本科植物中一类耐热性较强的作物,其热休克转录因子在调节其耐热性上起重要作用。因此,我们将OsPM1启动子与高粱热休克转录因子基因融合,转化到对热敏感的粳稻日本晴中并检测转基因株系的耐高温能力。

我们从高粱叶片的总cDNA中扩增到SbHsf03基因(LOC8085952)的cDNA全长,然后通过基因融合技术将SbHsf03与OsPM1基因上游2 152 bp长度的启动子融合,转化水稻日本晴。图4(a)、(b)分别为高粱热休克转录因子Sb Hsf03的蛋白结构域示意简图及OsPM1::SbHsf03融合基因转基因载体示意图。

图4 Sb Hsf03蛋白结构域示意简图及OsPM1::Sb Hsf03融合基因转基因载体示意图Fig.4 Schematic diagrams of Sb Hsf03 protein and the transgenic vector of OsPM1::Sb Hsf03

2.5 OsPM1::Sb Hsf03融合基因转基因株系耐高温能力鉴定

利用PCR的方法对2.4节描述的转基因株系进行检测,结果显示3个株系均转基因成功(图5(a))。将生长两周的野生型及OsPM1::SbHsf03融合基因的转基因株系E452-1、E452-2、E452-3的水稻苗放入45℃的培养箱中处理46 h后观察植株表型,发现OsPM1::SbHsf03融合基因的转基因株系较野生型卷叶更少(图5(b,c)),同时检测了处理前及高温处理后植物的丙二醛含量及离子泄漏率,结果表明:高温处理后,OsPM1::SbHsf03融合基因转基因株系的丙二醛含量及离子泄漏率都低于野生型,而处理前各株系的丙二醛含量和离子泄漏率均没有显著差异(图5(d,e)),说明在水稻中表达OsPM1::SbHsf03融合基因可以增强其耐热性,且对苗期正常情况下水稻的生长没有影响。

图5 OsPM1::Sb Hsf03融合基因转基因株系耐高温能力鉴定Fig.5 Characterization of the heat tolerance of OsPM1::Sb Hsf03 transgenic lines

2.6 OsPM1::Sb Hsf03融合基因转基因植株在长时间高温胁迫后具有更高的存活率

将野生型及OsPM1::SbHsf03融合基因的转基因植株E452的幼苗放入45℃的培养箱中处理1个月后观察植株表型,发现野生型植株几乎全部死亡(存活率:3.1%),OsPM1::SbHsf03融合基因的转基因植株全部存活(存活率:100%)(图6),进一步说明在水稻中表达OsPM1::SbHsf03融合基因可以增强植物的耐热性。

图6 热胁迫1个月后野生型及OsPM1::Sb Hsf03转基因植株E452的表型Fig.6 Phenotype of wild type and OsPM1::Sb Hsf03 transgenic plant E452 after 1 month of heat stress treatment

环境逆境是造成作物产量下降的一个主要因素,因此培育抗逆性强的作物是稳定作物产量的必经之路。然而,培育对单一胁迫(如干旱、盐碱、病原体等)耐受性增强的植物可能存在一定的风险,因为植物对不同的胁迫有独特的反应,增加对一种胁迫的耐受性可能以牺牲对另一种胁迫的耐受性为代价[26-27]。例如,一个耐旱性强的好氧水稻品种能够适应缺水环境,但是这个品种对根结线虫感染特别敏感,导致产量严重下降[28]。随着气候变化,越来越多的极端天气事件增加了植物在田间遭受多种胁迫的可能性。因此,有必要寻找能够同时响应多种胁迫的基因,进而培育能够同时抵御多种极端环境的作物品种。如水稻NAC家族转录因子Os NAC2的RNA干扰株系同时具有对干旱胁迫和高盐胁迫的耐受性[29];而在番茄中过表达自身的SIAREB1基因则能同时增强番茄对盐和干旱胁迫的耐受性[30]。OsPM1作为编码一种ABA转运蛋白的功能基因,过表达能够增强水稻的干旱耐受能力[7]。本文对OsPM1在抵御非生物胁迫中的作用进行了进一步研究,发现该基因还受渗透、高盐以及高温胁迫的诱导,并且过表达OsPM1后,水稻抵御渗透胁迫、高盐胁迫、高温胁迫的能力都得到了增强。因此,该基因作为一个能够在多种胁迫反应中发挥功能的基因,具有可用于培育兼具多种抗逆性的水稻品种的潜力。然而,由于本研究均为在实验室环境下模拟单一胁迫,至于在多种胁迫并存时尤其是在野外环境下OsPM1的转基因株系表现如何,还有待进一步研究。

在本研究中我们还发现,水稻热胁迫转录因子Os Hsf A2b、Os Hsf A2e、Os Hsf A3都对OsPM1有一定的转录激活作用。因此我们推测,OsPM1在水稻热胁迫响应中的功能很可能是通过Os Hsfs的直接或间接激活实现的,而OsPM1在各种非生物胁迫中更加详细的作用机制还需更深入的研究。

高温会严重降低水稻的产量。亚洲栽培稻分为籼亚种和粳亚种,其中籼稻耐热性强,而粳稻喜温却不耐热,因其各自适宜的生长环境不同在我国形成了“南籼北粳”的水稻种植格局[31]。相较于籼稻而言,粳稻米粒黏性更强,适口性好,因此也更受大众欢迎。南方的粳稻种植面积随着近年来“籼改粳”的不断推进展现出逐渐增加的态势,但粳稻耐热性差,导致其在高温年份严重减产。我国长江以南地区夏季温度经常在37℃以上,提高粳稻耐热性便尤为重要。因此我们以口感好但不耐热的粳稻日本晴为背景进行转基因,以获得兼具优质口感和耐热性的水稻品系。

目前已经有一些基因在水稻中过表达能够提高其耐热性。例如,将OsWRKY11与水稻HSP101启动子融合后转入水稻品种Sasanishiki中,其耐热性和耐旱性均得到增强[32];在亚洲水稻品种“长优1号”中异源表达拟南芥的AtPLC9基因后,其耐热性也显著增强[33]。在本研究中,我们选用了耐热性较强的禾本科植物高粱的热胁迫转录因子Sb Hsf03,将其编码基因在粳稻品种日本晴中异源表达,获得的转基因植物耐热性显著增强,45℃处理1个月后其存活率仍为100%。

在以往的研究中,有一些转基因植物在转入抗逆转录因子后,虽然抗逆性得到了显著提高,但植物出现了生长缺陷。例如,向水稻中转入玉米泛素启动子(Ubi-1)驱动的WRKY家族转录因子WRKY45的编码基因后,转基因水稻对稻瘟病菌的抗性增强,但植株生长迟缓[34];CaMV35s启动子或玉米泛素启动子驱动的水稻OsDREB1或拟南芥DREB1转入水稻后,转基因株系对干旱、高盐和低温胁迫的耐受性均增强,但在无胁迫的正常生长条件下也表现出生长迟缓[35]。有研究表明,将组成型启动子换为胁迫诱导型启动子能够在很大程度上减小过表达转录因子给转基因植株正常生长带来的不良影响。在拟南芥中过表达DREB1A激活了许多抗逆基因的表达,从而提高了植株对干旱、高盐和冻害的耐受性,但在正常生长条件下,使用CaMV35s启动子驱动DREB1A的转基因植株表现出严重的生长迟缓,相比之下,DREB1A在胁迫诱导型rd29A启动子驱动下对植物生长的影响很小,而且转基因植物的逆境耐受性比CaMV35s启动子驱动DREB1A的转基因植物更强[36]。在本研究中,我们利用OsPM1的胁迫诱导型启动子来驱动高粱热休克转录因子Sb Hsf03的编码基因,转化不耐热的粳稻日本晴,获得了既具有很强耐高温能力又不影响植株正常生长的粳稻品系。在农业生产中,热胁迫对水稻的影响主要在生殖生长期,生殖生长期高温会严重影响水稻的育性。本文主要鉴定了转基因品系在营养期的耐高温能力,为后续的耐热性鉴定奠定了基础,今后也将进一步观察该品系在生殖期高温天气下的结实率及耐热性变化。

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