LysM蛋白在植物免疫中的作用

秦春晓，李 莹，张咏雪，戴绍军

（1.东北林业大学生命科学学院东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150040；
2.上海师范大学生命科学学院上海植物种质资源工程技术研究中心，上海200234）

溶解素基序（LysM）一般由42～48个氨基酸残基组成，N端的16个氨基酸和C端的10个氨基酸相对保守［1］，含有对称的βααβ的拓扑结构，其中两个α螺旋位于双链反向平行的β折叠一侧［2］.除古细菌外，几乎所有生物都具有含LysM的蛋白质，且多为分泌蛋白或膜蛋白［3］.含LysM的植物受体激酶可以识别或感应共生菌并诱导其对真菌的抗性［4］.根据蛋白是否含有激酶结构域，LysM家族蛋白分为两类，包括LysM受体类蛋白（LYP）和LysM受体激酶（LYK）［2］，都在植物免疫应答中具有重要作用.

水稻几丁质激发子结合蛋白（CEBiP）胞外具有2个LysM结构域和1个跨膜域，是首个被鉴定的真菌几丁质触发子结合的多糖受体，在感知几丁质触发子和信号转导中发挥作用.敲除OsCEBiP基因的水稻植株，几丁质诱导的活性氧（ROS）爆发和下游几丁质响应基因被严重抑制［5］.此外，OsCERK1（chitin elicitor receptor kinase）含有1个LysM结构域、1个跨膜域和1个胞内激酶功能域，对水稻几丁质信号转导至关重要.敲低OsCERK1也会显著抑制几丁质诱导的防御反应.虽然OsCERK1不具有直接结合壳聚糖的能力.但在感知到几丁质寡糖信号后，OsCEBiP和OsCERK1会迅速形成异源二聚体，激活下游信号以进行防御反应［6］.此外，在水稻中OsLYP4和OsLYP6均含有LysM，作为感受细菌肽聚糖（PGN）和几丁质的共受体发挥作用，两者可以形成同源和异源二聚体，并与OsCEBiP相互作用，参与几丁质感知与信号转导过程［7］.

感 知 到 几 丁 质 后，OsCERK1与OsRacGEF1（guanine nucleotide exchange factors）互 作 并 将OsRacGEF1的C末端S549磷酸化，进而OsRacGEF1作为OsRac1的鸟嘌呤核苷酸交换因子激活OsRac1［8］，随后OsRac1与OsMAPK3/6（mitogen-activated protein kinase）互作并将其激活［9］.同时，OsCERK1与多种类受体胞质激酶（RLCK）互作.质膜上OsCERK1的激酶结构域与OsRLCK185互作并将其磷酸化［10］，进而OsRLCK185磷酸化OsMAPKKKε C末端调控域，从而级联磷酸化OsMAPKK4和MAPK3/6［11］，激活MAPK级联信号通路.OsMAPK3/6可以磷酸化bHLH转录因子OsRAI1，调节几丁质诱导基因OsPAL1和OsWRKY19的转录水平［9，12］，启动植物免疫应答反应.此外，OsCERK1也可以调控其他类受体胞质激酶，如OsRLCK57，OsRLCK107，OsRLCK118和OsRLCK176等，参与几丁质信号转导［13-15］，如图1（a）所示.

拟南芥基因组共编码5个LYK，包括LYK1/CERK1和LYK2～LYK5［16-17］.拟南芥AtCERK1含有3个LysM结构域、1个跨膜域和1个胞内激酶域［18］.与OsCERK1不同，AtCERK1可以直接与几丁质结合［19］，AtCERK1胞外的3个LysM结构域都是几丁质结合所必需的，任何一个LysM结构域缺失都会破坏其稳定的空间结构［20］.胞外的几丁质、几丁质寡聚体和壳聚糖与LysM结构域结合，导致AtCERK1同源二聚化，进而激活AtCERK1胞内近膜和激酶结构域的多个氨基酸快速磷酸化［20-21］.保守的跨膜结构域中C端近膜区（部分序列）也调节AtCERK1激酶活性，参与几丁质信号转导［22］.AtCERK1对几丁质的识别具有特异性，cerk1突变体中，几丁质触发的ROS爆发、MAPK级联反应，以及几丁质响应基因的表达等几乎都丧失了［18，23］.然而，AtCERK1对几丁质的亲和力相对较低.将AtCERK1几丁质结合位点A138突变为H并未阻断AtCERK1自磷酸化，这表明虽然AtCERK1是响应几丁质必需的，但是还有其他蛋白参与几丁质结合，并与AtCERK1互作共同激活下游信号通路［22］.拟南芥中的AtLYK4和AtLYK5可能具有这样的作用［24-25］.AtLYK4可以识别几丁质，作为AtCERK1的共受体增加其几丁质亲和性和激酶活性［24］.在lyk4突变体中，受几丁质诱导的基因转录水平下降，胞内钙离子（Ca2+）浓度增加受抑制，但其表型不如cerk1突变体明显［26］.此外，AtLYK5也是几丁质的主要受体，与AtCERK1形成几丁质诱导复合物，是几丁质诱导AtCERK1形成同源二聚体和磷酸化所必需的.AtLYK5与几丁质的亲和力比AtCERK1高很多，lyk5-2突变体对几丁质反应显著降低，缺乏ROS爆发表型.将点突的AtLYK5（AtLYK5S206P和AtLYK5Y128G）回补到lyk5-2突变体中，无法恢复其表型；
LYK5S206P不与几丁质结合，而AtLYK5Y128G与几丁质结合能力下降，这表明S206和Y128是AtLYK5调控几丁质结合的关键位点［25］.AtLYK4与AtLYK5的胞外域可以相互作用形成同源二聚体.几丁质诱导AtCERK1与AtLYK4，AtLYK5形成复合物［27］.正常状态下，AtCERK1，AtLYK4和AtLYK5均定位于质膜［28］；
几丁质触发后，磷酸化的AtCERK1仍停留在质膜上，而AtLYK5受到诱导而内化.然而，在cerk1或AtCERK1蛋白活性降低的突变植株中，没有发现几丁质诱导的AtLYK5内吞作用［28］.

拟南芥免疫应答过程中，AtCERK1介导的信号转导通路可能包括类受体胞质激酶AtBIK1（botrytisinduced kinase 1），AtBAK1（BRI1-associated receptor kinase 1），AtPBL1（BIK1-like protein kinase），AtPBL27和RLCKⅦ-4等组分.AtCERK1与AtBIK1互作并将其磷酸化［29］，AtBIK1能与AtBAK1互作［30］.AtBIK1和AtPBL1对几丁质诱导的胼胝质积累起作用，AtBIK1与过氧化氢（H2O2）积累也相关［29］.相比于AtBIK1，AtCERK1可以优先磷酸化AtPBL27，AtCERK1的磷酸化位点S493突变不影响其自磷酸化活性，却降低AtPBL27的转磷酸化水平，从而影响几丁质信号感知与转导的起始阶段［31］.拟南芥AtPBL27是水稻OsRLCK185的同源蛋白，可以磷酸化AtMAPKKK5，激活AtMKK2，AtMKK4和AtMKK5的磷酸化［32］，进而调节AtMAPK3/6［33］，调控相关防御基因（AtNit4和AtWRKY75）表达［33］.AtPBL27和AtMAPKKK5也参与几丁质诱导的胼胝质沉积［32-33］.AtCERK1也可以磷酸化RLCKⅦ-4，进而激活MAPK级联反应，启动免疫应答［34］，如图1（b）所示.此外，受细菌病原体诱导后，AtBAK1可以与AtCERK1互作，磷酸化AtCERK1的近膜区，增强植株真菌抗性［35］.

LysM蛋白响应几丁质的免疫过程也受到负调节因子的调控，从而保护植物生长免受几丁质诱导的持续性的免疫损伤［36］.目前，对此方面的认识仅仅局限于拟南芥AtCERK1相关的负调控研究.

AtCERK1调节的免疫过程可能受到蛋白质可逆磷酸化的调控.在感知几丁质信号后，AtCERK1会募集其互作蛋白PP2C丝/苏氨酸磷酸酶（CIPP1），使AtCERK1的Tyr428去磷酸化，AtCIPP1会与去磷酸化的AtCERK1解离，进而AtCERK1的Tyr428再发生自磷酸化并恢复待命（standby）状态［37］.此外，AtCERK1与富含亮氨酸重复的类受体激酶（LRR-RLK）LIK1互作并将其直接磷酸化，负调节几丁质触发的免疫过程［38］.几丁质处理后，lik1突变体植株会产生更多的ROS，AtMAPK3和AtMAPK6磷酸化水平显著增加，这表明AtCERK1磷酸化AtLIK1会抑制下游的信号通路，但对其分子调控机制并不清楚［38］，如图1（c）所示.

依赖或不依赖泛素连接酶U-box蛋白介导的蛋白质降解途径都可能对AtCERK1活性具有负调控作用.AtCERK1磷酸化的胞内激酶结构域与泛素连接酶U-box蛋白12或13（PUB12/13）的ARM结构域相互作用［36］，这表明几丁质激活AtCERK1的自磷酸化是其与AtPUB12/13相互作用的关键.pub12，pub13突变体几丁质诱导的ROS爆发、MAPK激活和胼胝质沉积等一系列免疫反应增强［36］.这暗示着AtPUB12和AtPUB13参与了几丁质受体复合物的负调控作用，这种负调控是否是通过泛素化AtCERK1介导其降解有待进一步研究.有意思的是，AtCERK1也可以与AtPUB4相互作用.从pub4突变体表型上看，PUB4正调节几丁质诱导的ROS产生和胼胝质沉积，负调节MAPK激活与防御基因表达，这种看起来相互矛盾的表型可能是pub4突变引用的水杨酸（SA）合成紊乱有关，但具体机制尚不清楚［39］.而AtCERK1的磷酸化位点S493突变会降低AtPUB4的转磷酸化水平［31］.此外，AtCERK1可以与RLCKⅦ-4家族中的组成型差异生长蛋白1（CDG1）互作并将其磷酸化.AtCDG1独立于PUB12/13途径来促进AtCERK1降解，进而负调节免疫反应.但该过程需要具有激酶活性的AtMEKK1参与，失活的AtMEKK1可以抑制AtCDG1介导的AtCERK1降解和免疫缺陷［40］，如图1（c）所示.

图1 植物LysM蛋白参与几丁质激活免疫反应通路.

含LysM的蛋白在不同植物中也参与多种生物学功能.如在感知几丁质和信号传导过程中，虽然AtLYK2有助于诱导胼胝质沉积，但是其作用并不明显.但AtLYK2会增强由鞭毛蛋白诱导的灰霉病菌和丁香假单胞菌的抗性，以及在真菌感染过程中激活防御基因的表达［41］.

棉花GhLYK1和GhLYK2具有结合几丁质的能力，受大丽轮枝菌感染后被诱导，对棉花抗黄萎病有一定的作用［42］.棉花GhLYP1，GhLYK7和细胞外LysM蛋白3（GhLysMe3）是识别几丁质信号的受体，可激活下游SA、茉莉酸（JA）和ROS信号通路，以及相关防御基因的表达，增强对黄萎病的抗性［43］.细胞壁相关激酶GhWAK7A直接与GhCERK1和GhLYK5相互作用［44］.被真菌病原菌感染后，GhLYK5识别几丁质，刺激GhLYK5与GhCERK1结合.GhWAK7A对GhLYK5的磷酸化或起支架（scaffolding）作用，可能促进GhLYK5与GhCERK1复合物的形成，从而启动下游ROS产生、MAPK激活和防御相关基因表达，提高黄萎病和枯萎病抗性［44］.

在桑树中鉴定了MmLYP1（CEBiP同源物）和MmLYK2（CERK1同源物）.用几丁质处理后，MmLYP1的表达显著上升，但MmLYK2没有明显变化.此外，MmLYP1对不溶性几丁质聚合物具有亲和力，而MmLYK2的亲和能力较低.这表明虽然MmLYP1缺乏胞内激酶结构域，但MmLYP1通过与MmLYK2相互作用参与几丁质信号转导［45］.

在番茄中，SlLYK1参与几丁质诱导的免疫反应，SlLYK10和SlLYK12参与调节丛枝菌根（AM）共生，而异源过表达SlLYK1和SlLYK13将诱导细胞死亡［46-47］.

LysM结构域作为一类古老并广泛存在的结构域，在植物免疫应答过程中起作用.LysM蛋白介导的植物免疫途径的调控机制已经取得了显著进展，但LysM蛋白对不同聚糖结构的特异性识别机制仍不清楚，其激酶可逆磷酸化与泛素化调节的蛋白质周转机制也有待研究.进一步挖掘免疫应答过程中LysM蛋白调控的下游因子并明确关键调控位点，解析LysM家族成员之间及其与其他膜定位类受体激酶在质膜上的招募与互作分子机制，明确LysM与其互作蛋白形成的分子模块对下游靶蛋白的调控作用，将为深入揭示LysM蛋白对植物免疫应答的分子调控机理提供重要信息.

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